The antibacterial mechanism of the novel bacteriocin LpH25 and the synergistic preservation effect of this bacteriocin and Nisin in fresh milk
新型细菌素 LpH25 的抗菌机制及其与乳酸链球菌素（Nisin）在生鲜乳中的协同保鲜效果
来源：LWT - Food Science and Technology 194 (2024) 115766
论文整体总结
该论文发表于 2024 年《LWT - Food Science and Technology》期刊，围绕鼠李糖乳杆菌 LS-8 来源的新型细菌素 LpH25 展开系统研究，全面解析了其结构特征、理化稳定性、对多种食源性致病菌的抗菌活性，首次揭示了其对革兰氏阴性菌与阳性菌的差异化抗菌机制，同时验证了 LpH25 与 Nisin 联用在生鲜乳中的协同保鲜效果。研究证实 LpH25 具备优异的加工稳定性与广谱抗菌活性，可通过不同作用靶点分别破坏大肠杆菌细胞膜与金黄色葡萄球菌细胞壁实现杀菌，与 Nisin 联用可显著延长生鲜乳的抑菌保质期，为食品工业开发安全、高效的天然防腐剂提供了重要的理论支撑与应用依据。
1. 论文摘要内容
细菌素作为食品工业中的天然防腐剂，已被证实对食源性致病菌具有强效抑制作用。本研究聚焦新型细菌素 LpH25 的结构、稳定性、抗菌机制，以及其与 Nisin 联用对牛乳中大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的协同抗菌效果。研究表明，鼠李糖乳杆菌 LS-8 的生长会受到酸性环境和胃蛋白酶的抑制；LpH25 是一种含芳香环的不饱和多肽，具备良好的两亲性；此外，细菌素 LpH25 展现出优异的热稳定性（121℃处理 30 min 仍保持活性）和宽 pH 稳定性（pH 2.5~11），在 - 80℃条件下可稳定保存超 270 天，且 2 小时内对多种酶不敏感。LpH25 可在 5 小时内对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、阪崎克罗诺杆菌发挥强效抑制活性。进一步实验发现，LpH25 可通过有效抑制大肠杆菌外膜与鞭毛的形成发挥抗菌活性，最终导致细胞死亡；而对金黄色葡萄球菌，LpH25 主要通过抑制肽聚糖合成实现生长抑制。此外，经 LpH25 与 Nisin 联合处理的污染牛乳中，致病菌活菌数可在 7 天内稳定维持在 6.5 log10 CFU/mL。本研究为推动新型抗菌剂开发、应对致病菌耐药性挑战、延长牛乳货架期提供了重要的理论支撑。
2. 论文关键词
细菌素、食源性致病菌、结构、抗菌机制、食品保鲜
3. 研究目的
系统解析新型细菌素 LpH25 的二级结构、官能团特征等结构属性，全面评估其热、pH、长期储存、酶敏感性等理化稳定性，明确其食品工业应用的基础特性；
测定 LpH25 对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、阪崎克罗诺杆菌、单核细胞增生李斯特菌等常见食源性致病菌的抗菌活性，明确其抑菌谱与作用规律；
揭示 LpH25 对革兰氏阴性菌（大肠杆菌）和革兰氏阳性菌（金黄色葡萄球菌）的具体抗菌机制，明确其差异化的作用靶点与杀菌路径；
探究 LpH25 单独及与食品工业常用细菌素 Nisin 联用，在生鲜乳体系中对致病菌的抑制效果与协同保鲜潜力，为生鲜乳天然保鲜提供新方案；
解决化学防腐剂带来的食品安全隐患、致病菌耐药性，以及 Nisin 在高蛋白高脂乳体系中活性易丧失的行业痛点，为开发安全高效的新型天然食品抗菌剂提供理论基础与实验依据。
4. 研究思路
菌株基础特性评估：通过体外模拟口腔、胃、肠道消化过程，测定鼠李糖乳杆菌 LS-8 在胃肠道环境中的存活能力，评估其作为产细菌素益生菌的应用潜力；
LpH25 结构解析：通过 PSIPRED、SWISS-MODEL、HeliQuest 等生物信息学工具预测 LpH25 的二级结构、立体模型、两亲性等特征，结合傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析其官能团，明确其结构与抗菌活性的构效关系；
抗菌活性测定：通过时间杀菌曲线实验，测定 LpH25 对 4 种食源性致病菌的抑菌动力学；利用 Bioscreen C 全自动生长曲线分析仪，测定异源表达 LpH25 的大肠杆菌生长情况，验证其抗菌活性的普适性；
理化稳定性评估：系统测定不同 pH、处理温度、长期储存条件、不同种类酶处理后，LpH25 抑菌活性的变化，明确其在食品加工复杂环境中的稳定性；
抗菌机制深度解析：通过细胞膜通透性实验、胞外 DNA 释放实验，评估 LpH25 对致病菌细胞膜的损伤作用；利用扫描电镜（SEM）、透射电镜（TEM）直观观察 LpH25 处理后细菌细胞形态与内部超微结构的变化；通过 RT-qPCR 检测细菌膜合成、细胞壁合成、鞭毛合成等相关基因的表达水平，在分子层面明确 LpH25 的作用靶点与差异化抗菌机制；
食品应用潜力验证：构建生鲜乳致病菌污染模型，测定 LpH25 单独、Nisin 单独及两者联用处理后，7 天内牛乳中致病菌菌落总数的动态变化，验证其协同保鲜效果；
数据整合与结论总结：整合多维度实验结果，明确 LpH25 的应用价值与局限性，形成最终研究结论。
5. 研究亮点
首次系统完成新型细菌素 LpH25 的全维度特性解析：全面明确了 LpH25 的结构特征、广谱抗菌活性与优异的加工稳定性，证实其在 121℃高温处理 30 min、pH 2.5~11 的宽范围、-80℃长期储存 270 天的条件下仍能保留核心抗菌活性，为其食品工业应用奠定了坚实基础。
揭示了同一种细菌素对革兰氏阴 / 阳性菌的差异化抗菌机制：证实 LpH25 对大肠杆菌主要通过抑制外膜与鞭毛合成、破坏细胞膜完整性实现杀菌，对金黄色葡萄球菌则通过抑制肽聚糖合成、破坏细胞壁发挥作用，填补了单一细菌素对两类致病菌呈现完全不同作用靶点的研究空白，为其精准应用提供了机制支撑。
解决了 Nisin 在生鲜乳体系中活性易丧失的行业痛点：证实 LpH25 与 Nisin 联用在生鲜乳中具有显著的协同抗菌效果，可使污染牛乳中致病菌活菌数稳定在 6.5 log10 CFU/mL 达 7 天，抑菌效果远优于两者单独使用，为生鲜乳的天然防腐保鲜提供了新型复合制剂方案。
验证了 LpH25 对多种高风险食源性致病菌的广谱抗菌活性：明确其对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、阪崎克罗诺杆菌、单核细胞增生李斯特菌均具有强效抑制作用，覆盖了乳制品中最常见的致病菌与条件致病菌，拓展了其在各类食品中的应用场景。
形成了从结构 - 活性 - 机制 - 应用的完整研究闭环：从结构生物学解析、理化稳定性评估，到抗菌机制的多维度验证，再到实际食品体系的应用测试，研究逻辑完整、证据链充分，为新型细菌素的开发与应用研究提供了标准化的研究范式。
6. 可延伸的方向
协同机制深度解析与应用体系拓展：深入探究 LpH25 与 Nisin 协同抗菌的分子机制，优化两者的最优复配比例、作用条件，进一步拓展至肉制品、发酵食品、果蔬饮料、水产品等其他食品体系的保鲜应用。
LpH25 的蛋白工程改造与产业化优化：通过定点突变、结构截短等蛋白工程手段，改造 LpH25 的蛋白酶稳定性、抗菌活性与表达效率，降低其工业化生产成本；同时构建诱导型异源表达系统，解决其自抑菌效应导致的发酵产量低的问题，推动其产业化制备。
安全性与合规性系统评估：开展 LpH25 的体内毒理学、致敏性、胃肠道稳定性等安全性评价，完成食品添加剂应用的合规性数据积累，为其获批食品添加剂使用标准提供支撑。
生物被膜抑制作用研究：系统探究 LpH25 对食源性致病菌生物被膜的形成抑制与成熟被膜清除作用，解析其抗被膜机制，拓展其在食品加工接触面消毒、冷链物流防腐中的应用。
复合天然保鲜体系开发：探究 LpH25 与植物精油、多酚、壳聚糖等其他天然抗菌物质的协同抗菌效果，开发多重复合天然保鲜体系，进一步提升抑菌广谱性与应用稳定性。
耐药菌防控应用研究：评估 LpH25 对多重耐药食源性致病菌的抗菌活性，探究其逆转细菌耐药性的机制，为耐药菌防控提供新型天然抗菌剂。
肠道菌群影响与体内应用探索：评估 LpH25 对人体肠道共生菌的影响，明确其对肠道致病菌的靶向抑制作用，探索其在调节肠道微生态、防控肠道感染中的应用潜力。
7. 测量的数据、对应图表及研究意义
体外模拟口腔、胃、肠道消化过程中，鼠李糖乳杆菌 LS-8 的菌落总数动态变化数据，对应图 1；研究意义：明确了 L. rhamnosus LS-8 在口腔消化中活性受影响极小，酸性胃液环境会显著抑制其生长，但在肠道环境中可恢复增殖，证实了该菌株具备一定的胃肠道耐受性，为其作为益生菌及产细菌素菌株的体内应用提供了基础数据。
LpH25 的二级结构预测、电荷分布、拉氏构象图、螺旋轮投影、亲疏水性、傅里叶变换红外光谱、结构稳定性预测数据，对应图 2A-2G；研究意义：系统解析了 LpH25 的结构特征，证实其以 α- 螺旋为主要结构、具备良好的两亲性，是含芳香环的不饱和多肽，明确了其结构与抗菌活性的构效关系，为理解其抗菌机制、后续蛋白工程改造提供了结构生物学基础。
LpH25 处理下 4 种食源性致病菌的时间杀菌曲线，以及异源表达 LpH25 的大肠杆菌 BL21 (DE3) 的生长动力学数据，对应图 3A、3B；研究意义：证实了 LpH25 可在 5 小时内显著抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、阪崎克罗诺杆菌的生长，1 小时内抑制单核细胞增生李斯特菌，明确了其对不同致病菌的抑菌模式差异，为后续抗菌机制研究设定了标准化的作用时间与浓度条件。
不同 pH、处理温度、长期储存条件、不同酶处理下，LpH25 对 4 种致病菌的抑菌活性变化数据，对应图 4A-4D；研究意义：系统明确了 LpH25 的理化稳定性，证实其具备优异的热稳定性、宽 pH 稳定性与长期储存稳定性，对非蛋白酶类不敏感，明确了其在食品工业复杂加工、储存条件下的应用潜力。
LpH25 处理后大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞膜电位动态变化数据，对应图 5；研究意义：证实了 LpH25 可在 3 分钟内快速破坏致病菌的细胞膜电位，大幅提升细胞膜通透性，明确了细胞膜损伤是 LpH25 发挥抗菌作用的初始关键步骤，为后续抗菌机制解析提供了细胞膜层面的直接证据。
不同浓度 LpH25 处理 1h、2h、3h 后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的胞外 DNA 释放浓度数据，对应表 2；研究意义：量化了 LpH25 对致病菌细胞膜的破坏程度，证实其对大肠杆菌的膜破坏作用呈浓度和时间依赖性，对金黄色葡萄球菌的膜损伤在 1 小时内达到峰值，进一步验证了两者的差异化抗菌机制，明确了 LpH25 可通过膜破裂导致胞内内容物外泄，最终引发细菌死亡。
LpH25 处理 0.5h、2h 后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞表面形态超微结构变化数据，对应图 6（SEM 图像）；研究意义：直观可视化了 LpH25 对致病菌细胞形态的时间依赖性损伤作用，证实其可导致大肠杆菌细胞膜皱缩、破裂、胞质外泄，金黄色葡萄球菌细胞变形、凹陷、膜穿孔，从形态学层面直接证实了 LpH25 对细菌细胞结构的破坏作用。
LpH25 处理 0.5h、2h 后，大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的细胞内部超微结构变化数据，对应图 7（TEM 图像）；研究意义：在亚细胞层面解析了 LpH25 对致病菌的损伤过程，证实其可导致大肠杆菌细胞内囊泡形成、内容物消散、细胞裂解，金黄色葡萄球菌胞内 DNA 弥散、空泡形成、细胞膜破裂，进一步揭示了其对革兰氏阴性和阳性菌的差异化作用过程。
RT-qPCR 检测用的靶基因引物序列、扩增产物长度数据，对应表 1；研究意义：为 LpH25 抗菌机制的转录水平验证提供了标准化的引物体系，保障了 RT-qPCR 实验的准确性与可重复性，是基因表达水平检测的核心基础。
LpH25 处理 2h 后，大肠杆菌膜合成与鞭毛合成相关基因、金黄色葡萄球菌细胞壁合成与 DNA 复制相关基因的相对表达水平数据，对应图 8；研究意义：在转录水平验证了 LpH25 的抗菌机制，证实其可显著下调大肠杆菌外膜合成、鞭毛合成相关基因的表达，抑制金黄色葡萄球菌肽聚糖合成相关基因的表达，从分子层面明确了其对两类菌的差异化作用靶点，与电镜、膜通透性实验结果形成完整的证据链。
LpH25 单独、Nisin 单独及两者联用处理后，生鲜乳中致病菌菌落总数的 7 天动态变化数据，对应图 9；研究意义：证实了 LpH25 与 Nisin 联用在生鲜乳体系中具有显著的协同抗菌效果，可使致病菌活菌数稳定在 6.5 log10 CFU/mL 达 7 天，抑菌效果显著优于两者单独使用，解决了 Nisin 在乳体系中活性快速丧失的问题，为 LpH25 在生鲜乳保鲜中的实际应用提供了直接的实验数据支撑。
8. 研究结论
鼠李糖乳杆菌 LS-8 来源的新型细菌素 LpH25 是一种具备良好两亲性的不饱和多肽，理化性质稳定：具有优异的热稳定性（121℃处理 30 min 仍保留核心抗菌活性）、宽 pH 稳定性（pH 2.5~11），-80℃储存 270 天仍保留 72% 以上的抗菌活性；对脂肪酶、过氧化氢酶、α- 淀粉酶不敏感，仅长时间蛋白酶处理会导致其活性部分下降。
LpH25 对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、阪崎克罗诺杆菌、单核细胞增生李斯特菌等多种重要食源性致病菌具有显著的抑菌活性，且对不同致病菌呈现差异化的抑菌模式，仅对单核细胞增生李斯特菌表现为生长抑制而非杀菌作用。
LpH25 对革兰氏阴性菌和阳性菌具有完全不同的抗菌机制：对大肠杆菌，可通过抑制外膜合成与鞭毛形成、增加细胞膜通透性，造成膜穿孔与胞内内容物外泄，最终导致细菌死亡；对金黄色葡萄球菌，则主要通过抑制肽聚糖合成、破坏细胞壁结构，阻碍细胞正常代谢、增殖与分裂，最终引发细胞死亡。
LpH25 与 Nisin 联用在生鲜乳储存中对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌具有显著的协同抑菌效果，可使污染牛乳中致病菌活菌数稳定在 6.5 log10 CFU/mL 达 7 天，抑菌效果显著优于两者单独使用，展现出其作为生鲜乳保鲜辅助抗菌剂的巨大应用潜力。
LpH25 作为新型天然细菌素，具备替代化学防腐剂的良好应用前景，可为食品工业开发安全高效的新型天然抗菌剂提供重要的理论支撑；但其与 Nisin 的协同效果在不同食品底物和储存条件下可能存在差异，工业化大规模应用前仍需开展更系统、深入的研究。
9. 芬兰 Bioscreen 仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义详细解读
本研究中使用芬兰 Bioscreen C 全自动微生物生长曲线分析仪，测定了携带 LpH25 编码序列的大肠杆菌 BL21 (DE3) 与空载质粒对照菌株的全周期生长动力学数据，检测参数为 OD600 吸光度值、每 1 小时自动检测一次、37℃恒温培养、每次检测前 10 秒震荡、持续监测 30 小时、每组设置 3 次生物学重复，最终获得的生长曲线数据对应图 3B，其核心研究意义分为以下 6 个层面：
直接验证 LpH25 的自抑菌活性，明确其抗菌作用的普适性
Bioscreen 仪器的全自动连续检测，精准捕捉了异源表达 LpH25 的大肠杆菌 BL21 (DE3) 在整个培养周期内生长受到显著抑制，而空载对照菌株可正常生长增殖的动态过程。这一结果直接证实了 LpH25 不仅对外源食源性致病菌具有抗菌活性，还能对其异源表达的宿主大肠杆菌产生强效生长抑制作用，明确了其抗菌作用的普适性，排除了 “抗菌活性仅针对特定菌株” 的可能性，为 LpH25 的广谱抗菌特性提供了直接的实验证据。
实现生长过程的动态连续监测，避免终点法的结果误判
传统的菌液浓度终点检测法，仅能获得固定时间点的单一 OD 值数据，无法区分 “菌株生长完全受抑” 与 “生长滞后期延长” 两种完全不同的生物学表型，极易出现假阴性或假阳性的结果误判。而 Bioscreen 仪器每 1 小时一次的高频连续检测，完整记录了菌株 30 小时内的滞后期、指数生长期、平台期全生长周期动态，清晰展现了携带 LpH25 的大肠杆菌在整个培养周期内生长始终处于显著抑制状态，而非单纯的生长延迟，从根本上避免了终点法可能带来的结果偏差，保证了 LpH25 抗菌活性表型判断的绝对准确性。
保证实验的高重复性与数据可靠性，提升结论的严谨性
微生物生长实验的重复性是研究结论可靠性的核心基础，人工手动检测不仅耗时耗力，还极易因取样操作、环境温度波动、检测时间偏差等因素引入系统误差。Bioscreen 仪器的自动化检测模式，可实现上百个样品的同步恒温培养、标准化震荡与 OD 值检测，最大程度消除了人工操作与环境波动带来的误差。本研究中设置了 3 次生物学重复，仪器的标准化检测流程保证了组内重复数据的高度一致性，证实了 LpH25 对宿主菌生长的抑制作用是稳定、可重复的，大幅提升了研究结论的严谨性与说服力。
为 LpH25 的抗菌活性提供了定量的动力学数据支撑
Bioscreen 仪器输出的连续 OD600 时序数据，可精准量化菌株的最大生长速率、最大生物量、滞后期时长等关键生长动力学参数。通过对比实验组与对照组的生长曲线，可定量评估 LpH25 对细菌生长的抑制强度，明确其在异源表达体系中持续发挥抗菌作用的时间窗口。这些定量数据不仅为 LpH25 抗菌效价的标准化测定建立了方法体系，也为后续其异源表达制备、发酵生产工艺优化提供了关键的动力学参考。
为后续抗菌机制研究与食品应用实验设定了基础参照
该生长曲线数据明确了 LpH25 在细菌对数生长期即可发挥显著的生长抑制作用，为后续时间杀菌曲线、细胞膜通透性实验、电镜超微结构观察、RT-qPCR 基因表达检测等抗菌机制研究，设定了标准化的药物作用时间与浓度梯度，保证了后续实验体系的一致性与结果的可比性。同时，该数据也证实了 LpH25 在液体培养体系中可稳定发挥抗菌活性，为其在液态食品（如生鲜乳、饮料）中的保鲜应用提供了前期的方法学验证，是后续生鲜乳协同保鲜实验的重要基础。
为 LpH25 的工业化生产提供了关键的工艺优化方向
异源表达是细菌素工业化规模化制备的核心方式，而 Bioscreen 仪器测定的生长曲线，明确了 LpH25 对其表达宿主大肠杆菌具有显著的自抑制效应，这一发现为 LpH25 的工业化发酵生产提供了关键的优化方向 —— 需构建严谨的诱导型表达系统，在宿主菌生长至高菌体密度后再诱导 LpH25 表达，从而解决自抑菌效应导致的菌体生物量低、目的蛋白产量不足的问题，为该细菌素的产业化应用提供了重要的理论指导。