The role of glnR gene in heat and oxidative stress cross-adaptation in Lacticaseibacillus rhamnosus
glnR 基因在鼠李糖乳杆菌热胁迫与氧化胁迫交叉适应中的作用
来源：LWT - Food Science and Technology 201 (2024) 116278
论文整体总结
该论文发表于 2024 年《LWT - Food Science and Technology》期刊，针对鼠李糖乳杆菌热与氧化胁迫交叉适应的分子机制空白，以全局氮代谢调控因子 glnR 为研究对象，通过无痕基因敲除构建了 glnR 缺失突变株 glnRm，结合转录组测序、多维度胁迫表型验证、喷雾干燥应用测试等手段，首次证实 glnR 是连接鼠李糖乳杆菌热胁迫与氧化胁迫交叉适应的核心调控基因。研究解析了 GlnR 通过调控氮源转运与代谢相关基因的转录，介导两种胁迫交叉适应的分子机制，明确了该基因是决定菌株喷雾干燥存活率、以及预处理提升菌粉存活率效应的关键靶点，为揭示乳酸菌复杂胁迫协同耐受机制、提升益生菌在食品工业加工中的存活率提供了重要的理论基础与全新的研究方向。
1. 论文摘要内容
交叉适应是复杂胁迫条件下发生的一种有趣且具有重要价值的生理现象。鼠李糖乳杆菌可通过下调氮源转运与代谢相关基因的转录，实现对热胁迫和氧化胁迫的交叉适应。本研究通过基因敲除，探究了被推测为全局氮调控因子的 glnR 基因在该过程中的作用。在热胁迫条件下，glnR 突变株（glnRm）中有 305 个基因上调、293 个基因下调；而在氧化胁迫条件下，该菌株有 156 个基因上调、161 个基因上调。野生型菌株中受热和氧化胁迫共同下调的大部分氮源代谢相关基因，在相同条件下的 glnR 突变株中不再产生响应。经热或氧化胁迫预处理后，glnRm 菌株的热与氧化胁迫交叉适应能力弱于野生型菌株。此外，glnR 突变株在喷雾干燥过程中存活率极低，且热和氧化预处理无法再提升其存活率。这些发现表明，鼠李糖乳杆菌的 glnR 基因能够响应热和氧化胁迫，并成为连接两种胁迫耐受性的关键节点，为提升鼠李糖乳杆菌喷雾干燥过程中的存活率提供了新的研究方向。
2. 论文关键词
鼠李糖乳杆菌、热胁迫、氧化胁迫、glnR 基因、交叉适应
3. 研究目的
明确全局氮代谢调控因子 glnR 基因在鼠李糖乳杆菌热胁迫与氧化胁迫交叉适应（H-OCA）中的核心作用，填补两种胁迫耐受性关键连接元件的研究空白；
解析 glnR 调控热、氧化胁迫响应的转录组机制，明确其靶基因与调控网络，揭示氮代谢调控与乳酸菌双重胁迫耐受性的内在关联；
验证 glnR 基因缺失对鼠李糖乳杆菌酸、冷、热、氧化等基础胁迫耐受性的影响，明确其调控胁迫响应的特异性；
探究 glnR 基因对鼠李糖乳杆菌喷雾干燥存活率的影响，以及热 / 氧化预处理提升菌粉存活率的效应是否依赖于 glnR 的完整存在，为工业生产提供应用靶点；
整合转录组与表型数据，阐明 glnR 介导鼠李糖乳杆菌热与氧化胁迫交叉适应的分子机制，为提升乳酸菌在食品加工中的胁迫耐受性提供理论支撑。
4. 研究思路
基因编辑与菌株构建：通过同源重组系统构建鼠李糖乳杆菌 hsryfm 1301 的 glnR 基因无痕敲除突变株 glnRm，经 PCR 验证敲除成功，无外源抗性标记插入，为后续研究提供核心实验材料；
基础生长特性评估：利用芬兰 Bioscreen C 全自动微生物生长曲线分析仪，测定野生型与 glnRm 菌株在不同氮源培养基中的全周期生长曲线，明确 glnR 缺失对菌株基础生长的影响，排除生长缺陷对后续胁迫实验的干扰；
转录组水平的机制解析：对 glnRm 菌株开展对照组、热预处理组、氧化预处理组的 RNA-seq 测序，分析差异表达基因与 KEGG 通路富集特征；通过去阻遏系数（DRC）量化 glnR 对胁迫响应基因的调控作用，明确野生型中两种胁迫下共同下调的氮源相关基因在 glnRm 中的响应变化；
胁迫表型与交叉适应验证：系统测定野生型与 glnRm 菌株的酸、冷、热、氧化基础胁迫耐受性，以及不同预处理后的交叉适应能力（HPH、OPH、HPO、OPO），明确 glnR 缺失对热 - 氧化交叉适应的影响；
工业应用场景验证：测定喷雾干燥过程中，野生型与 glnRm 菌株的基础存活率，以及热、氧化预处理对两者存活率的影响，验证 glnR 在实际食品加工胁迫中的功能；
机制整合与结论总结：结合转录组数据与表型结果，构建 GlnR 介导热与氧化胁迫交叉适应的调控通路，形成完整的研究结论，明确其科学价值与应用前景。
5. 研究亮点
首次明确了 glnR 是乳酸菌热 - 氧化胁迫交叉适应的核心调控基因：填补了乳酸菌中氮代谢全局调控因子参与多重胁迫交叉适应的研究空白，证实 GlnR 是连接两种胁迫耐受性的关键节点，完善了乳酸菌复杂胁迫响应的调控网络认知。
揭示了 GlnR 介导胁迫交叉适应的分子机制：证实 GlnR 通过靶向调控 23 个氨基酸 / 肽转运基因、11 个氨基酸代谢相关基因的转录，介导热与氧化胁迫的交叉适应，在分子层面验证了低氮源摄入提升乳酸菌双重胁迫耐受性的科学假说。
拓展了 GlnR 在乳酸菌中的生物学功能认知：首次发现 GlnR 除了经典的氮代谢调控与酸胁迫适应功能外，还作为慢响应调控因子，介导乳酸菌热与氧化胁迫的预适应过程，明确了其调控胁迫响应的特异性与普适性。
明确了 glnR 是益生菌喷雾干燥存活率的关键决定基因：证实 glnR 缺失会显著降低鼠李糖乳杆菌喷雾干燥的基础存活率，且热 / 氧化预处理提升菌粉存活率的效应完全依赖于 glnR 的存在，为工业生产中提升益生菌菌粉存活率提供了全新的基因靶点与调控策略。
形成了转录组 - 表型匹配的完整研究闭环：通过无痕基因敲除、多时间点转录组测序、多维度胁迫表型验证、工业应用场景测试，系统解析了 glnR 的基因功能，研究逻辑严谨、证据链完整，为乳酸菌胁迫响应的功能基因组学研究提供了标准化范式。
6. 可延伸的方向
GlnR 全基因组调控网络的精准解析：通过 ChIP-seq 等技术，明确热与氧化胁迫下 GlnR 在鼠李糖乳杆菌基因组中的直接结合靶位点，构建其完整的胁迫响应调控网络，区分直接调控与间接调控的靶基因。
glnR 在乳酸菌多重胁迫交叉适应中的普适性验证：探究 glnR 基因在酸、渗透压、冷冻干燥、胆盐等其他食品加工相关胁迫中的作用，明确其是否为乳酸菌多重胁迫交叉适应的全局调控因子；同时验证该机制在乳杆菌属、乳球菌属其他益生菌中的保守性。
高胁迫耐受性工程菌株的构建与应用：通过启动子工程、定点突变等手段对 glnR 基因进行表达调控或功能改造，构建热 / 氧化胁迫耐受性显著提升的鼠李糖乳杆菌工程菌株，验证其在喷雾干燥、冷冻保藏、乳制品发酵中的应用性能。
营养调控与 glnR 介导的胁迫耐受性的关联优化：探究发酵培养基的氮源种类、浓度、添加时机对 glnR 表达及菌株胁迫耐受性的影响，建立基于氮源营养调控的益生菌高耐受性发酵工艺，实现工业化低成本的菌株抗逆性提升。
glnR 缺失后胁迫响应补偿机制的深度解析：系统研究 glnR 缺失后，嘌呤、嘧啶代谢相关的补救基因在热 / 氧化胁迫响应中的补偿作用，完善乳酸菌多重胁迫响应的全局调控网络，明确胁迫响应的主通路与旁路调控关系。
glnR 改良菌株的益生功能与安全性评估：开展 glnR 改造菌株的体内外益生功能、胃酸 / 胆盐耐受性、肠道定殖能力、毒理学安全性评估，验证其在发酵食品、益生菌制剂中的应用安全性与有效性，推动产业化落地。
GlnR 作为靶点的益生菌抗逆性高通量筛选体系建立：基于 glnR 的表达水平与菌株胁迫耐受性的关联，构建 glnR 启动子驱动的荧光报告系统，建立益生菌高抗逆性菌株的高通量筛选体系。
7. 测量的数据、对应图表及研究意义
glnR 基因的基因组位点特征、同源物种系统发育分析数据，以及 glnR 基因敲除的 PCR 验证电泳数据，对应图 1a、图 1b；研究意义：明确了鼠李糖乳杆菌 hsryfm 1301 中 glnR 基因位于 glnRA 操纵子的基因组结构特征，成功构建了无外源序列插入的 glnR 无痕敲除突变株 glnRm，为后续基因功能研究提供了无抗性标记干扰的核心实验材料。
鼠李糖乳杆菌野生型 hsryfm 1301 与 glnRm 菌株在 0P-MRS、MRS、2P-MRS、Gln-MRS 四种不同氮源培养基中的全周期生长曲线数据，对应图 1c、图 1d、图 1e、图 1f；研究意义：明确了 glnR 基因缺失仅在低氮源条件下轻微延缓菌株生长，在高氮源、谷氨酰胺补充培养基中不影响菌株的基础生长特性，证实后续胁迫实验中的表型差异并非由菌株基础生长缺陷导致，保证了实验结果的因果可靠性。
glnRm 菌株对照组、热预处理组、氧化预处理组转录组测序的主成分分析（PCA）数据，对应图 2a；研究意义：证实了转录组测序技术重复具有高度重复性，热胁迫和氧化胁迫均能诱导 glnRm 菌株产生显著的转录组差异，为后续差异表达基因分析提供了数据质量的基础验证。
热预处理后 glnRm 菌株的差异表达基因数量、功能分类及 KEGG 通路富集分析数据，对应图 2b；研究意义：明确了 glnR 缺失后，菌株在热胁迫下有 305 个基因上调、293 个基因下调，差异基因主要富集在组氨酸代谢、核糖体、脂肪酸生物合成等通路，揭示了 glnR 缺失后菌株热胁迫响应的全局转录变化特征。
氧化预处理后 glnRm 菌株的差异表达基因数量、功能分类及 KEGG 通路富集分析数据，对应图 2c；研究意义：明确了 glnR 缺失后，菌株在氧化胁迫下有 156 个基因上调、161 个基因下调，差异基因主要富集在组氨酸代谢、淀粉和蔗糖代谢、丙氨酸 - 天冬氨酸 - 谷氨酸代谢等通路，揭示了 glnR 缺失后菌株氧化胁迫响应的转录调控特征。
热和氧化胁迫下 glnRm 菌株的重叠差异表达基因数量、调控方向分类及 KEGG 富集分析数据，对应图 2d；研究意义：明确了两种胁迫下共有 109 个重叠响应基因，仅 53.2% 为同向调控，其中共同上调基因主要参与嘌呤代谢，共同下调基因主要参与嘧啶代谢和双组分系统，揭示了 glnR 缺失后菌株对两种胁迫响应的共性与特异性。
野生型菌株中受热、氧化胁迫共同下调，但在 glnRm 中解除下调响应的氮源转运、氨基酸代谢及肽酶相关基因列表，对应图 3a；研究意义：明确了 glnR 缺失后，23 个氨基酸和肽转运基因、11 个氨基酸代谢相关基因、5 个肽酶基因在热和氧化胁迫下的下调效应被完全缓解，证实这些基因是 GlnR 的核心靶标，也是其介导两种胁迫交叉适应的关键功能基因。
69 个靶基因的热胁迫去阻遏系数（H-DRC）与氧化胁迫去阻遏系数（O-DRC）的皮尔逊相关性分析数据，对应图 3b；研究意义：证实了 H-DRC 与 O-DRC 呈极显著正相关（皮尔逊 r=0.8461，P<0.0001），明确了 GlnR 对热和氧化胁迫响应的调控具有高度一致性，从转录组层面直接证实了 GlnR 是连接两种胁迫耐受性的核心调控元件。
野生型与 glnRm 菌株的酸胁迫、冷胁迫耐受性存活率数据，对应图 4a；研究意义：证实了 glnR 缺失会显著降低菌株的酸胁迫耐受性，验证了 GlnR 在乳酸菌酸适应中的保守功能，同时明确了 glnR 缺失不影响菌株的冷胁迫耐受性，揭示了 GlnR 调控胁迫响应的特异性。
野生型与 glnRm 菌株无预处理、热预处理、氧化预处理后的热胁迫耐受性存活率数据，对应图 4b；研究意义：明确了 glnR 缺失不影响菌株对直接热胁迫的基础耐受性，但会显著削弱热预处理提升热耐受性（HPH）、氧化预处理提升热耐受性（OPH）的效应，证实了 GlnR 是热 - 氧化交叉适应中 OPH 表型的核心调控因子。
野生型与 glnRm 菌株无预处理、热预处理、氧化预处理后的氧化胁迫耐受性存活率数据，对应图 4c；研究意义：明确了 glnR 缺失不影响菌株对直接氧化胁迫的基础耐受性，也不影响氧化预处理提升氧化耐受性（OPO）的效应，但会显著削弱热预处理提升氧化耐受性（HPO）的效应，证实了 GlnR 是热 - 氧化交叉适应中 HPO 表型的核心调控因子。
喷雾干燥用高菌体密度菌液中，野生型与 glnRm 菌株无预处理、热预处理、氧化预处理后的热胁迫耐受性存活率数据，对应图 5a；研究意义：在工业发酵的实际应用场景下，再次验证了 glnR 缺失会显著削弱 HPH 和 OPH 耐受性，证实 GlnR 介导的交叉适应在菌株不同生长阶段均稳定存在，为工业化应用提供了可靠的表型数据支撑。
喷雾干燥用高菌体密度菌液中，野生型与 glnRm 菌株无预处理、热预处理、氧化预处理后的氧化胁迫耐受性存活率数据，对应图 5b；研究意义：在高菌体密度条件下，验证了 glnR 缺失会显著削弱 HPO 耐受性、不影响 OPO 耐受性，与对数生长期的表型完全一致，进一步巩固了 GlnR 在热 - 氧化交叉适应中的核心作用。
野生型与 glnRm 菌株无预处理、热预处理、氧化预处理后的喷雾干燥存活率数据，对应图 5c；研究意义：证实了 glnR 缺失会显著降低鼠李糖乳杆菌喷雾干燥的基础存活率，且热、氧化预处理提升喷雾干燥存活率的效应在 glnRm 菌株中完全消失，明确了 GlnR 是决定乳酸菌喷雾干燥存活率的关键基因，也是预处理提升菌粉存活率的核心分子基础。
GlnR 介导鼠李糖乳杆菌热和氧化胁迫协同耐受的机制通路图，对应图 6；研究意义：系统整合了 GlnR 的靶基因与调控通路，直观呈现了 GlnR 通过调控氮源转运代谢、嘌呤嘧啶代谢等通路，介导热 - 氧化交叉适应的分子机制，为整个研究的核心结论提供了可视化的机制总结。
本研究中使用的菌株、质粒的来源、基因型与抗性信息，对应表 1；研究意义：明确了研究中所有生物材料的背景信息，保证了实验的可重复性，为后续相关研究提供了菌株与质粒的参考信息。
本研究中使用的所有引物的序列、限制性酶切位点信息，对应表 2；研究意义：提供了 glnR 基因敲除、突变体验证的全部引物序列，保证了基因编辑实验的可重复性，为后续鼠李糖乳杆菌的基因功能研究提供了引物参考。
8. 研究结论
本研究通过基因敲除与多组转录组 - 表型匹配分析，首次明确了 glnR 基因是连接鼠李糖乳杆菌热胁迫与氧化胁迫耐受性的核心基因。
GlnR 介导的胁迫响应是鼠李糖乳杆菌热与氧化胁迫抗性渐进式适应系统的前置活动，也是菌株热 - 氧化交叉适应的主要成因。
在分子水平上证实了氮源摄入的减少有助于提升鼠李糖乳杆菌的热与氧化胁迫耐受性，而这一效应完全由 GlnR 的转录调控介导。
glnR 基因是决定鼠李糖乳杆菌喷雾干燥存活率的关键基因，热与氧化预处理提升菌株喷雾干燥存活率的效应，完全依赖于 glnR 基因的完整存在。
本研究结果揭示了乳酸菌应对复杂胁迫协同耐受的分子机制，为提升乳酸菌在食品工业加工中的胁迫耐受性与存活率提供了全新的研究方向与基因靶点。
9. 芬兰 Bioscreen 仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义详细解读
本研究中使用芬兰 Bioscreen C 全自动微生物生长曲线分析仪，测定了鼠李糖乳杆菌野生型 hsryfm 1301 与 glnR 敲除突变株 glnRm，在 0P-MRS（无胰蛋白胨）、MRS（基础胰蛋白胨）、2P-MRS（高胰蛋白胨）、Gln-MRS（谷氨酰胺补充）四种不同氮源培养基中的全周期生长曲线，通过恒温培养、标准化震荡、自动化 OD600 检测，实现了菌株生长过程的高通量、高时间分辨率、平行化监测，最终获得的生长数据对应图 1c、图 1d、图 1e、图 1f，其核心研究意义分为以下 7 个层面：
明确 glnR 缺失对菌株基础生长的影响，排除生长缺陷对核心实验的干扰
Bioscreen 仪器的连续动态检测，完整捕捉了两菌株在四种氮源培养基中的全生长周期特征，明确了 glnR 基因缺失仅在低氮源的 0P-MRS 和基础 MRS 培养基中轻微延缓菌株生长，而在高氮源的 2P-MRS 和谷氨酰胺补充的 Gln-MRS 培养基中，突变株与野生型的生长特性完全一致，均在 16 小时后进入稳定期。这一结果直接证实了 glnR 基因并非鼠李糖乳杆菌的生长必需基因，其缺失不会造成菌株的基础生长缺陷，后续胁迫耐受性、转录组测序、喷雾干燥实验中观察到的表型差异，完全源于 glnR 基因缺失对胁迫响应调控的影响，而非菌株生长能力的改变，从根本上保证了整个研究核心实验结果的可靠性与因果关系的准确性。
验证 glnR 的氮代谢核心调控功能，明确其调控的营养条件依赖性
Bioscreen 仪器输出的定量生长数据，直观呈现了菌株生长对氮源浓度与种类的依赖性：在低氮环境中，glnR 缺失导致菌株生长速率显著下降，而在高氮或谷氨酰胺补充的环境中，这种生长差异完全消失。这一结果与 GlnR 作为革兰氏阳性菌全局氮代谢调控因子的经典功能完全契合，证实了鼠李糖乳杆菌中 GlnR 主要在低氮条件下发挥氮代谢的转录调控作用，高氮条件下其功能可被其他代谢通路补偿，为后续解析 GlnR 通过氮代谢调控胁迫响应的机制提供了基础的营养生理学依据。
为后续胁迫实验设定标准化培养条件，保证实验体系的一致性
本研究中所有的胁迫耐受性检测、转录组测序、喷雾干燥实验，均使用基础 MRS 培养基进行菌株培养。Bioscreen 仪器测定的生长曲线，精准明确了两菌株在 MRS 培养基中的生长动力学特征，确定了菌株对数生长期的 OD600 范围（0.5-0.6）、稳定期的 OD600 值与到达时间，为后续胁迫预处理、RNA 提取、菌液收集设定了精准的取样时间点与菌体浓度标准，保证了所有生物学重复实验的培养条件与菌体生理状态的高度一致性，大幅降低了实验的系统误差。
实现多组样品的平行同步检测，保证生长数据的高重复性与可比性
微生物生长实验的重复性是数据可靠性的核心基础，Bioscreen 仪器的高通量检测模式，可实现数十个样品的同步恒温培养、标准化震荡与 OD 值自动检测，最大程度消除了人工取样、培养环境波动、检测时间偏差带来的系统误差。本研究中四种培养基、两个菌株的生长曲线均设置了生物学重复，仪器的自动化检测保证了组内重复数据的高度一致，清晰呈现了不同氮源条件下两菌株的生长差异，避免了人工终点检测可能带来的结果误判，保证了生长数据的统计学可靠性。
提供菌株生长的定量动力学参数，为后续发酵工艺优化提供基础数据
Bioscreen 仪器输出的连续 OD600 时序数据，可精准量化菌株的最大比生长速率、迟滞期时长、最大生物量等关键生长动力学参数。这些定量数据不仅明确了 glnR 缺失对菌株生长的影响程度，还为后续鼠李糖乳杆菌的高密度发酵、益生菌菌粉的工业化生产提供了关键的工艺参数参考，尤其是发酵培养基氮源优化的核心方向，为通过营养调控提升菌株发酵效率与胁迫耐受性提供了直接的数据支撑。
为转录组数据的解读提供表型基础，完善基因功能的逻辑验证
转录组分析发现，glnR 缺失后大量氮源转运与代谢相关基因的胁迫响应发生了显著改变，而 Bioscreen 仪器测定的不同氮源下的生长表型，与转录组层面的基因功能变化形成了完美的对应与互证。低氮条件下 glnRm 生长受抑，对应了 GlnR 对氮源转运基因的核心调控作用；高氮条件下生长恢复，对应了其他氮代谢通路的补偿效应。这种表型 - 转录组的匹配验证，完善了 glnR 基因功能解析的逻辑闭环，让 GlnR 介导胁迫响应的调控机制更具说服力。
为 glnR 基因工程菌株的产业化应用提供安全性与可行性的初步验证
益生菌菌株的生长特性是其产业化应用的核心前提，Bioscreen 仪器的生长曲线数据证实，glnR 基因缺失不会影响菌株在高氮营养条件下的正常生长与增殖，说明即使对 glnR 进行表达调控改造，也不会阻碍菌株在乳制品、发酵食品等富营养体系中的正常发酵与定殖。这一结果为后续通过 glnR 基因工程改造构建高胁迫耐受性的益生菌工程菌株，提供了基础的安全性与可行性验证，推动了研究成果从基础研究向产业化应用的转化。