MdtG-mediated L-arabinose efflux inhibits Cronobacter sakazakii biofilm formation
MdtG介导的L-阿拉伯糖外排抑制阪崎克罗诺杆菌生物被膜形成
来源:LWT - Food Science and Technology 234 (2025) 118561
1. 论文摘要
阪崎克罗诺杆菌是一种主要感染婴幼儿和老年人的食源性致病菌，其能够形成难以清除的生物被膜。D 型糖类是细菌生物被膜形成过程中常见的群体感应抑制剂，而 L 型糖类及其对应的外排泵在阪崎克罗诺杆菌生物被膜形成中的作用相关研究较少。本研究通过基因敲除的方法，探究了多重耐药外排泵 MdtG 在阪崎克罗诺杆菌生物被膜形成中的作用与分子机制。结果表明，MdtG 被证实是一种新型 L - 阿拉伯糖外排泵，能够外排作为群体感应信号分子 AI-2 活性抑制剂的 L - 阿拉伯糖，通过下调肽聚糖含量、胞外多糖分泌、细胞膜通透性、运动能力、自聚集能力和菌体细胞长度，抑制阪崎克罗诺杆菌的生物被膜形成水平。本研究揭示了多重耐药外排泵 MdtG 对阪崎克罗诺杆菌生物被膜形成的影响及分子机制，同时发现了一种可用于防控该菌生物被膜形成的新型群体感应抑制剂 ——L - 阿拉伯糖。
2. 论文关键词（中文，单行合并）
阪崎克罗诺杆菌、生物被膜、外排泵、L - 阿拉伯糖、自诱导物 - 2（AI-2）
3. 研究目的
① 探究多重耐药外排泵 MdtG 在阪崎克罗诺杆菌生物被膜形成中的生物学作用与分子调控机制，填补该菌中外排泵直接调控生物被膜形成的研究空白。
② 验证 MdtG 的底物转运功能，明确其对 L - 阿拉伯糖的外排作用，揭示 L - 阿拉伯糖对阪崎克罗诺杆菌 AI-2 群体感应系统与生物被膜形成的调控效应。
③ 明确 L - 阿拉伯糖作为新型群体感应抑制剂的应用潜力，为食品工业中阪崎克罗诺杆菌生物被膜污染的防控提供新的作用靶点与防控策略。
4. 研究思路
① 生物被膜相关基因的全基因组筛选：利用 EZ-Tn5 转座子构建阪崎克罗诺杆菌随机突变文库，通过结晶紫染色筛选生物被膜形成能力发生显著变化的突变株；经 Tail-PCR 扩增与测序比对，结合 NCBI、UniProt 数据库功能注释，锁定对生物被膜形成具有显著调控作用的 mdtG 基因。
② 实验菌株的构建与验证：基于同源重组原理，利用自杀质粒 pLP12 构建 mdtG 基因无痕敲除株 ΔmdtG，通过低拷贝质粒 pACYC184 构建回补株 cpmdtG；设计多对特异性引物，经 PCR 扩增与琼脂糖凝胶电泳验证菌株构建成功。③ 菌株生长特性的基础分析：采用芬兰 Bioscreen C PRO 全自动生长曲线分析仪，测定野生株 WT、敲除株 ΔmdtG、回补株 cpmdtG 的 24h 全周期生长曲线，排除生长速率差异对后续生物被膜实验的干扰；通过扫描电镜、菌落形态观察，分析 mdtG 缺失对菌体细胞长度、菌落形态与颜色的影响。④ 生物被膜相关表型的系统测定：通过结晶紫染色定量检测 24h、48h 的生物被膜生物量，结合 SYBR Green I 荧光染色与高分辨率显微镜观察，直观验证生物被膜形成能力的差异；提取生物被膜胞外基质，检测多糖、蛋白、DNA 的含量，明确 MdtG 调控生物被膜的核心作用靶点。⑤ 菌株生理特性的检测：测定 mdtG 缺失对菌株外膜通透性、初始黏附能力、自聚集能力、游泳与群集运动能力的影响，解析 MdtG 调控生物被膜形成的生理表型基础。⑥ MdtG 的转运功能探究：通过蛋白序列同源比对，推测 MdtG 的 L - 阿拉伯糖转运功能；测定菌株在以 L - 阿拉伯糖为唯一碳源的 M9 培养基中的生长情况，验证其无 L - 阿拉伯糖摄入功能；通过酶联免疫试剂盒检测胞内与胞外 L - 阿拉伯糖含量，明确 MdtG 的 L - 阿拉伯糖外排功能。⑦ 分子调控机制的深度解析：检测菌体肽聚糖含量，结合 RT-qPCR 检测 L - 阿拉伯糖代谢、肽聚糖合成相关基因的转录水平，解析胞内 L - 阿拉伯糖积累的下游效应；通过外源添加梯度浓度 L - 阿拉伯糖，验证其对生物被膜形成与 AI-2 活性的抑制作用；RT-qPCR 检测 AI-2 群体感应系统及下游生物被膜相关基因的表达水平，阐明完整的调控通路。
⑧ 结果整合与结论总结：整合全流程实验数据，绘制 MdtG 介导阪崎克罗诺杆菌生物被膜形成的机制通路图，明确 MdtG 的生物学功能与 L - 阿拉伯糖的群体感应抑制作用，得出最终研究结论。
5. 研究亮点
① 首次揭示了 MFS 家族多重耐药外排泵 MdtG 的全新生物学功能，证实其是一种新型 L - 阿拉伯糖外排泵，打破了该蛋白仅参与细菌抗生素耐药的传统认知，拓展了对细菌外排泵底物谱与生理功能的研究边界。
② 首次发现 L - 阿拉伯糖是阪崎克罗诺杆菌的新型无毒群体感应抑制剂，可通过抑制 AI-2 信号活性调控生物被膜形成，填补了 L 型糖类在该菌群体感应与生物被膜调控中的研究空白，为天然食品级抑菌剂的开发提供了新的候选分子。③ 系统阐明了 MdtG 调控阪崎克罗诺杆菌生物被膜形成的双重分子机制：一方面通过外排 L - 阿拉伯糖提升胞外浓度，抑制 AI-2 群体感应活性，进而调控菌株黏附、运动、胞外多糖合成等生物被膜相关表型；另一方面通过调控胞内 L - 阿拉伯糖代谢，影响肽聚糖合成与菌体形态，进一步调控生物被膜形成，完善了外排泵 - 糖代谢 - 群体感应 - 生物被膜的交叉调控通路。
④ 为食源性致病菌阪崎克罗诺杆菌的生物被膜防控提供了双重全新策略：既可以 MdtG 为靶点开发特异性外排泵抑制剂，也可利用 L - 阿拉伯糖作为食品级群体感应抑制剂，在婴幼儿配方粉、谷物食品等该菌易污染的食品体系中具有重要的实际应用价值。
6. 可延伸的研究方向
① MdtG 转运功能的结构生物学解析：通过蛋白晶体结构解析、定点突变实验，明确 MdtG 结合与外排 L - 阿拉伯糖的关键结构域与氨基酸位点，揭示其底物识别与转运的分子机制；同时筛选 MdtG 的其他转运底物，进一步完善其生物学功能图谱。
② L - 阿拉伯糖抑制 AI-2 活性的分子机制探究：明确 L - 阿拉伯糖的作用靶点，验证其是直接与 AI-2 分子结合、抑制 LuxS 介导的 AI-2 合成，还是竞争性结合 AI-2 受体 RbsB 阻断信号传递，揭示其作为群体感应抑制剂的精准作用模式。③ 食品基质中的实际应用效果验证：在婴幼儿配方粉、液态奶、谷物制品等阪崎克罗诺杆菌易污染的真实食品体系中，验证 L - 阿拉伯糖对该菌生物被膜形成的抑制效果，评估其食品安全性、稳定性与工业化应用潜力。④ 基于 MdtG 靶点的抑菌技术开发：筛选 MdtG 的特异性小分子抑制剂，验证其与消毒剂、抗生素的协同抑菌效果，开发可用于食品加工设备、食品接触材料的抗菌涂层，提升对阪崎克罗诺杆菌生物被膜的清除效率。⑤ 调控机制的跨物种保守性验证：探究 MdtG 同源蛋白、L - 阿拉伯糖外排 - AI-2 群体感应调控通路在大肠杆菌、沙门氏菌等其他肠杆菌科食源性致病菌中是否保守，拓展该机制的适用范围，为多种致病菌的生物被膜防控提供通用策略。
⑥ 复合抑菌体系的开发：将 L - 阿拉伯糖与黄芩苷、银杏素等已报道的天然群体感应抑制剂联用，探究其对阪崎克罗诺杆菌生物被膜的协同抑制效应，开发高效、安全的复合食品抑菌剂。
7. 测量数据、对应图表及研究意义
① 生物被膜相关基因的筛选与功能注释数据
数据内容：通过 EZ-Tn5 转座子获得 1048 个阪崎克罗诺杆菌插入突变株，筛选得到 20 个与生物被膜形成相关的基因，其中 mdtG 插入突变株的生物被膜形成能力提升至野生型的 1.4 倍；对 20 个基因进行 GO 注释与功能分类，明确其分子功能、生物学过程与细胞定位。
数据来源：Fig 1. GO annotation and functional classification of genes related to biofilm formation.、Fig S1、Table S1、Table S2
研究意义：完成了阪崎克罗诺杆菌生物被膜调控基因的全基因组筛选，首次发现 mdtG 基因对该菌生物被膜形成具有显著负调控作用，为整个研究锁定了核心靶点，同时丰富了该菌生物被膜形成的调控基因库。
② mdtG 敲除株与回补株的 PCR 验证数据
数据内容：设计 4 对特异性引物，以 WT、ΔmdtG、cpmdtG 的基因组 DNA 为模板进行 PCR 扩增，电泳结果显示 ΔmdtG 中 mdtG 基因被卡那霉素抗性片段成功替换，cpmdtG 中成功导入完整的 mdtG 基因序列。
数据来源：Fig 2. Specific primers used for PCR validation.（A、B 子图）、Table 1 Bacterial strains and plasmids used in this study.、Table 2 Primers used in this study.
研究意义：从分子水平验证了敲除株与回补株构建成功，为后续所有表型与机制实验提供了可靠的实验材料，确保实验结果的特异性与准确性。
③ 菌株生长曲线与基础形态学数据
数据内容：测定 WT、ΔmdtG、cpmdtG 在 LB 培养基中 24h 的生长曲线，三株菌同时进入对数期与稳定期，生长速率无显著差异；扫描电镜观察显示 ΔmdtG 菌体细胞长度显著增加；ΔmdtG 与 WT、cpmdtG 的菌落形态、颜色存在明显差异。
数据来源：Fig 3. Growth characteristics of the WT, ΔmdtG, and cpmdtG.（A、B、C、D 子图）
研究意义：彻底排除了 mdtG 缺失导致的生长速率变化对后续生物被膜实验的干扰，确保生物被膜表型差异是由 mdtG 基因功能缺失直接导致的；同时发现 mdtG 缺失会影响菌体形态与菌落特征，为后续机制解析提供了表型线索。
④ 生物被膜形成能力与胞外基质组分数据
数据内容：结晶紫染色结果显示，24h 时 ΔmdtG 的成熟生物被膜生物量较 WT 显著提升，WT 与 cpmdtG 无显著差异；荧光显微镜观察显示 ΔmdtG 的生物被膜荧光区域更密集、更厚；胞外基质检测显示，ΔmdtG 的胞外多糖含量为 WT 的 1.45 倍，蛋白与 DNA 含量无显著变化。
数据来源：Fig 4. Biofilm related characteristics determination of WT, ΔmdtG, and cpmdtG.（A、B、C、D、E、F 子图）
研究意义：直接证实 mdtG 基因负调控阪崎克罗诺杆菌的生物被膜形成，明确其调控作用主要通过影响胞外多糖合成实现，锁定了该基因调控生物被膜的核心表型靶点。
⑤ 菌株生理特性相关数据
数据内容：ΔmdtG 的外膜通透性荧光强度为 WT 的 1.2 倍，较 WT 显著提升；ΔmdtG 的初始黏附细胞数量、自聚集能力较 WT 显著升高；ΔmdtG 在 0.3%、0.5% 琼脂半固体平板上的游泳、群集运动能力显著下降，高浓度琼脂下表型更明显。
数据来源：Fig 5. Physiological properties change of WT, ΔmdtG, and cpmdtG.（A、B、C、D 子图）
研究意义：解析了 MdtG 调控生物被膜形成的生理基础，明确其通过调控菌株细胞膜通透性、初始黏附、自聚集与运动能力，进而影响生物被膜的形成过程，为后续分子机制解析提供了生理表型支撑。
⑥ MdtG 的 L - 阿拉伯糖转运功能相关数据
数据内容：蛋白序列比对显示 MdtG 与大肠杆菌 L - 阿拉伯糖转运蛋白 AraJ 具有 24.41% 的氨基酸同源性；ΔmdtG 与 WT 在以 L - 阿拉伯糖为唯一碳源的 M9 培养基中生长无显著差异；ΔmdtG 的胞内 L - 阿拉伯糖含量显著高于 WT，胞外含量显著低于 WT。
数据来源：Fig 6. MdtG-mediated L-arabinose efflux regulates peptidoglycan synthesis, biofilm formation, and AI-2 activity.（A、B 子图）、Fig S2
研究意义：首次证实 MdtG 不具备 L - 阿拉伯糖摄入功能，而是一种新型 L - 阿拉伯糖外排泵，明确了其核心转运底物，打破了对 MdtG 功能的传统认知，为后续机制解析奠定了核心功能基础。
⑦ 肽聚糖含量与相关基因表达数据
数据内容：ΔmdtG 的肽聚糖含量提升至 WT 的 1.7 倍；RT-qPCR 结果显示，ΔmdtG 中 L - 阿拉伯糖代谢基因 araA、araB、araD，磷酸戊糖途径基因 zwf，肽聚糖合成关键基因 murA 的转录水平均显著上调。
数据来源：Fig 6C、D、E
研究意义：揭示了胞内 L - 阿拉伯糖积累的下游效应，即通过上调自身代谢与磷酸戊糖途径，促进肽聚糖合成前体生成，最终提升肽聚糖含量；明确了 MdtG 通过调控胞内 L - 阿拉伯糖代谢影响肽聚糖合成，进而调控菌体形态与生物被膜形成的第二条通路。
⑧ L - 阿拉伯糖对生物被膜与 AI-2 活性的抑制作用数据
数据内容：外源添加 L - 阿拉伯糖可部分抑制阪崎克罗诺杆菌生物被膜形成，添加量超过 0.2 g/L 后抑制效应不再增强；L - 阿拉伯糖对该菌的 AI-2 活性具有显著抑制作用，抑制趋势与生物被膜一致。
数据来源：Fig 6F、G
研究意义：首次证实 L - 阿拉伯糖是阪崎克罗诺杆菌的新型群体感应抑制剂，可通过抑制 AI-2 活性发挥抗生物被膜作用，明确了 MdtG 通过外排 L - 阿拉伯糖调控 AI-2 群体感应系统的核心通路。
⑨ AI-2 群体感应系统相关基因的表达数据
数据内容：RT-qPCR 结果显示，ΔmdtG 中鞭毛相关基因 fliP、flgN，外膜脂蛋白基因 lpp 显著下调；AI-2 受体基因 rbsB、curli 合成调控基因 crl、胞外多糖合成基因 wzb、生物素合成基因 bioH 显著上调。
数据来源：Fig 6H
研究意义：从转录水平验证了 AI-2 群体感应系统是 MdtG 与 L - 阿拉伯糖调控生物被膜形成的核心下游靶点，明确了 AI-2 通过调控运动、黏附、胞外多糖合成、膜通透性相关基因，最终影响生物被膜形成的分子机制。
⑩ 调控机制整合数据
数据内容：整合全流程实验结果，绘制了 MdtG 介导阪崎克罗诺杆菌生物被膜形成的完整机制通路图。
数据来源：Fig 7. Mechanism of MdtG mediated biofilm formation of C. sakazakii.
研究意义：系统总结了 MdtG 调控阪崎克罗诺杆菌生物被膜形成的双重分子机制，直观呈现了外排泵、L - 阿拉伯糖代谢、AI-2 群体感应与生物被膜形成之间的调控关系，为该领域后续研究提供了清晰的理论框架。
⑪ 胞内 c-di-GMP 含量检测数据
数据内容：ΔmdtG 与 WT 的胞内 c-di-GMP 含量无显著差异。
数据来源：Fig S3
研究意义：排除了 c-di-GMP 信号通路参与 MdtG-L - 阿拉伯糖对阪崎克罗诺杆菌生物被膜的调控，进一步聚焦了 AI-2 群体感应系统的核心作用，确保了机制解析的准确性。
8. 核心研究结论
① 多重耐药外排泵 MdtG 具备全新的 L - 阿拉伯糖外排功能，是一种新型的 L - 阿拉伯糖外排泵，其不仅参与细菌抗生素耐药，还对阪崎克罗诺杆菌的生物被膜形成具有显著的负调控作用。
② L - 阿拉伯糖是阪崎克罗诺杆菌的新型群体感应抑制剂，MdtG 可通过外排 L - 阿拉伯糖提升胞外 L - 阿拉伯糖水平，抑制 AI-2 群体感应信号分子的活性；同时减少胞内 L - 阿拉伯糖积累，降低肽聚糖合成，最终通过双重通路抑制阪崎克罗诺杆菌的生物被膜形成。③ MdtG 通过调控 AI-2 群体感应系统，进而影响菌株的肽聚糖含量、胞外多糖分泌、细胞膜通透性、运动能力、自聚集能力、菌体细胞长度与初始黏附能力，实现对生物被膜形成的多维度调控。
④ 本研究丰富了 MdtG 外排泵对阪崎克罗诺杆菌生物被膜形成的影响与分子机制的认知，同时 L - 阿拉伯糖作为新型群体感应抑制剂，为开发防控细菌生物被膜的新型食品级抑菌剂、抗菌材料提供了重要的理论基础与应用方向。
9. 芬兰 Bioscreen 仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中，采用芬兰 Bioscreen C PRO 全自动生长曲线分析仪，对 WT、ΔmdtG、cpmdtG 三株菌株进行了 24h 生长曲线测定，每小时检测一次 OD600 值，获得了菌株全生长周期的动态数据，该数据是整个研究的重要基础，其核心研究意义分为以下 6 个层面：
① 排除了菌株生长能力差异对生物被膜表型实验的核心干扰，是整个研究表型实验成立的关键前提
生物被膜的形成能力与细菌的生长速率直接相关，若 mdtG 基因缺失导致菌株生长速率发生显著变化，将无法区分生物被膜表型的改变是由基因功能缺失直接导致，还是由生长能力变化间接引起。芬兰 Bioscreen 仪器通过全自动、连续 24h 的高频 OD600 检测，获得了三株菌完整的生长动力学曲线，精准证实了 WT、ΔmdtG、cpmdtG 同时进入延滞期、对数期与稳定期，全周期生长速率无显著性差异，彻底排除了生长因素对后续生物被膜、黏附、运动等所有表型实验的干扰，确保了实验结果的因果性与可靠性。
② 提供了高精度、高重复性的生长动力学数据，保障了实验结果的准确性
传统手动分光光度计法测定生长曲线，存在取样操作误差、培养环境温度波动、检测时间间隔长、批次间差异大等问题，难以获得精准的生长动力学数据。而芬兰 Bioscreen C PRO 仪器具备恒温密闭培养、持续震荡、多通道全自动同步检测的特性，实现了三株菌、多个生物学重复在完全一致的培养环境中同步生长与检测，大幅降低了人为操作与环境因素带来的系统误差，获得的生长曲线数据具有极高的重复性与精确度，为菌株生长特性的评估提供了可靠的定量数据支撑。
③ 实现了菌株全生长周期的动态监测，精准捕捉了基因缺失对菌株生长的全面影响
该仪器以 1 小时为间隔的连续检测，完整覆盖了菌株的延滞期、对数期、稳定期全生长周期，相较于传统的离散时间点检测，能够精准捕捉 mdtG 基因缺失是否会导致菌株延滞期长短、对数期比生长速率、稳定期最大生物量等生长周期关键节点的变化。实验结果不仅排除了对数期生长速率的影响，还验证了延滞期、稳定期无显著差异，证实 mdtG 基因不参与阪崎克罗诺杆菌的基础生长代谢，其功能特异性地体现在生物被膜调控中，进一步锁定了基因的核心功能。
④ 验证了回补株的功能回补效果，完善了菌株构建的有效性验证
基因回补实验是微生物基因功能研究的关键验证环节，除了分子水平的 PCR 验证，生理水平的生长表型回补是菌株构建成功的重要佐证。Bioscreen 仪器获得的生长曲线显示，cpmdtG 回补株的生长特征与野生型 WT 完全一致，从生理水平验证了 mdtG 基因的成功回补与功能恢复，进一步证实了后续表型差异确实由 mdtG 基因缺失导致，完善了菌株构建的有效性验证体系。
⑤ 建立了标准化的阪崎克罗诺杆菌生长表型评价体系，为后续相关研究提供了方法学参考
本研究基于芬兰 Bioscreen 仪器建立的阪崎克罗诺杆菌生长曲线测定方法，具备高通量、自动化、高重复性的特点，可推广至该菌其他基因功能研究的生长表型评价中。同时，该方法为后续评估 L - 阿拉伯糖、抑菌剂等外源物质对阪崎克罗诺杆菌生长的影响，以及筛选 MdtG 抑制剂等实验提供了标准化的评价体系，大幅提升了后续相关实验的效率与数据可靠性。
⑥ 为该菌株的后续食品防控应用研究提供了基础生长动力学参数通过 Bioscreen 仪器获得的生长曲线数据，明确了阪崎克罗诺杆菌野生株在 LB 培养基中的生长动力学特征，包括对数期的时间范围、比生长速率、稳定期的生物量等关键参数，为后续该菌在食品基质中的污染规律研究、抑菌剂的作用效果评价、食品加工过程中的污染防控策略开发等应用研究，提供了基础的生长动力学数据支撑。