全自动生长曲线分析仪

Synergistic inhibition mechanism of pediocin PA-1 and L-lactic acid against Aeromonas hydrophila

片球菌素 PA-1 与 L - 乳酸对嗜水气单胞菌的协同抑制机制

来源：BBA - Biomembranes 1862 (2020) 183346

1. 论文摘要

片球菌素 PA-1（PA-1）是乳酸菌产生的一类膜靶向细菌素，对多种革兰氏阳性致病菌具有抗菌活性，但革兰氏阴性菌的外膜会阻止其接触作用靶点。本研究解析了 PA-1 与 L - 乳酸对水产养殖及食品领域重要的革兰氏阴性致病菌嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）的协同抑制机制。结果显示，3.5 mmol/L L - 乳酸与 50 μmol/L（或 30 μmol/L）PA-1 联合处理，对嗜水气单胞菌具有强效的抑菌和杀菌活性。全波长扫描与 ELISA 检测发现，L - 乳酸处理会导致嗜水气单胞菌外膜的脂多糖（LPS）释放；FITC 标记 PA-1 的激光共聚焦显微成像证实，PA-1 可在乳酸预处理的细菌细胞上大量积累。随后，PA-1 会快速消散经乳酸预处理的嗜水气单胞菌的膜电位（Δψ）和质子梯度差（ΔpH），同时引起胞外 ATP 水平升高。扫描电镜（SEM）和透射电镜（TEM）的形态学观察显示，乳酸与 PA-1 联合处理会诱导细菌细胞表面囊泡形成、内外膜结构破坏，甚至引发细胞质泄漏和细胞裂解。综上，本研究证实了二者协同抑制嗜水气单胞菌的潜在机制：L - 乳酸通过释放细菌外膜 LPS，使 PA-1 能够接触嗜水气单胞菌的质膜，进而导致内膜质子动力势消散，最终引发细菌死亡。

2. 论文关键词

革兰氏阴性致病菌、细菌素、乳酸、细胞膜、抑制作用

3. 研究目的

① 明确片球菌素 PA-1 与 L - 乳酸联合使用，对革兰氏阴性致病菌嗜水气单胞菌的协同抑菌、杀菌活性，确定二者协同作用的有效浓度范围；

② 揭示 L - 乳酸与 PA-1 协同抑制嗜水气单胞菌的分子级联机制，阐明 L - 乳酸打破革兰氏阴性菌外膜屏障、PA-1 发挥内膜损伤作用的核心过程；③ 验证 “L - 乳酸释放外膜 LPS→PA-1 结合质膜→质子动力势消散→细胞死亡” 的作用通路，填补细菌素与有机酸协同抗革兰氏阴性菌的机制研究空白；

④ 为乳酸菌及其代谢产物在水产养殖病害防控、水产品生物防腐中，针对嗜水气单胞菌的绿色防控方案开发提供理论依据和实验支撑。

4. 研究思路

① 协同抑菌表型的定量验证：通过 96 孔板培养测定 12h 终点 OD600，确定 PA-1 与 L - 乳酸对两株嗜水气单胞菌的最小抑菌浓度 MIC90；利用芬兰 Bioscreen C 全自动生长曲线分析仪，连续 48h 动态检测不同处理组的细菌生长曲线，结合修正 Gompertz 模型解析迟滞期、最大比生长速率等关键生长参数，验证二者的协同抑菌活性；通过 PI 染色结合流式细胞术，测定不同处理时长下的细菌致死率，明确二者的协同杀菌效应。

② 外膜屏障破坏的机制解析：通过 190~210nm 全波长紫外扫描和 ELISA 试剂盒，定量检测不同浓度、不同时长 L - 乳酸处理后，嗜水气单胞菌外膜 LPS 的释放量，证实 L - 乳酸对细菌外膜的通透性破坏作用；通过激光共聚焦显微镜观察 FITC 标记的 PA-1 在乳酸预处理 / 未预处理细菌上的分布，验证 LPS 释放后 PA-1 能否结合到细菌细胞上。③ 内膜损伤与能量代谢干扰的分析：采用荧光探针 DisC3 (5) 和 BCECF，分别检测 PA-1 对乳酸预处理细菌的跨膜电位 ΔΨ 和质子梯度 ΔpH 的动态影响，明确 PA-1 对质子动力势（PMF）的消散作用；通过增强型 ATP 检测试剂盒测定胞外 ATP 水平，结合 260nm、280nm 吸光度检测，分析联合处理对细胞膜通透性、胞内核酸和蛋白质泄漏的影响。④ 细胞超微结构损伤的直观验证：通过扫描电子显微镜（SEM）和透射电子显微镜（TEM），分别观察单独处理、联合处理后嗜水气单胞菌的表面形貌变化和细胞内部超微结构损伤，从形态学层面直观证实二者的协同损伤效应。

⑤ 机制整合与结论总结：整合表型验证、外膜 - 内膜层级损伤分析、物质泄漏检测、超微结构观察的完整证据链，阐明 L - 乳酸与 PA-1 协同抑制嗜水气单胞菌的完整作用机制，明确该组合的实际应用潜力。

5. 研究亮点

① 首次系统阐明了 IIa 类细菌素片球菌素 PA-1 与 L - 乳酸对嗜水气单胞菌的协同抑菌杀菌机制，突破了片球菌素仅对革兰氏阳性菌有活性的应用瓶颈，拓展了其在革兰氏阴性菌防控中的应用场景。

② 从外膜到内膜的层级损伤视角，完整揭示了二者协同作用的分子级联过程：明确 L - 乳酸通过释放嗜水气单胞菌外膜 LPS 打破屏障，使 PA-1 能够接触并作用于细菌质膜，进而消散质子动力势、增加膜通透性，最终导致细菌死亡，为细菌素与有机酸的协同抗菌机制提供了完整、严谨的实验证据。③ 采用多维度、可视化的技术体系，从生长表型、致死率、外膜成分释放、细菌素细胞定位、膜电位变化、胞内物质泄漏到细胞超微结构变化，形成了闭环的证据链，全面证实了二者的协同效应与作用机制，结论具有极强的说服力。④ 研究聚焦于水产养殖和食品领域的多重耐药致病菌嗜水气单胞菌，为该菌的绿色防控提供了乳酸菌源天然抗菌物质的新方案，契合水产养殖减抗替抗、食品生物防腐的行业需求，具备重要的实际应用价值。

⑤ 证实了乳酸菌的两种核心抗菌代谢产物（乳酸、细菌素）的协同增效作用，为益生菌发酵产物、复合生物保鲜剂的开发提供了理论基础，也为乳酸菌在水产养殖和食品保藏中的产业化应用提供了全新思路。

6. 可延伸的研究方向

① 拓展研究其他乳酸菌细菌素（如 nisin、植物乳杆菌素等）与乳酸对嗜水气单胞菌，以及大肠杆菌、沙门氏菌、铜绿假单胞菌等其他重要革兰氏阴性致病菌的协同抗菌效应，明确该协同作用模式的普适性。

② 深入解析片球菌素 PA-1 在嗜水气单胞菌内膜上的特异性作用靶点（如甘露糖磷酸转移酶系统），明确其在革兰氏阴性菌中发挥作用的分子识别与结合机制。③ 结合转录组学、定量蛋白质组学，分析乳酸与 PA-1 联合处理对嗜水气单胞菌全基因组转录、蛋白表达的调控网络，进一步完善协同抑制的分子机制。④ 开展乳酸与 PA-1 在水产养殖水体、鲜活水产品贮藏中的实际应用验证，评估二者在真实应用场景中的抑菌效果、稳定性与生物安全性，开发基于二者的复合生物保鲜剂、水产养殖抑菌制剂。⑤ 优化乳酸与 PA-1 的复配比例、作用条件，结合包埋、固定化等制剂技术，提升二者在复杂应用环境中的稳定性与长效抑菌活性。⑥ 探究乳酸与 PA-1 联合处理诱导的嗜水气单胞菌外膜囊泡（OMVs）的生物学功能，明确其对细菌毒力、种间交流的影响，评估该处理方式的潜在应用风险。

⑦ 研究乳酸与 PA-1 联合使用与水产养殖常用抗生素、消毒剂的协同效应，探索针对嗜水气单胞菌感染的减抗、替抗复合防控方案。

7. 测量的数据、对应图表及研究意义

① 嗜水气单胞菌生长抑制与生长动力学数据

数据内容：不同浓度 PA-1 单独处理、3.5mmol/L L - 乳酸单独处理、二者联合处理 12h 后，嗜水气单胞菌 ATCC 35654 和 CICC 10500 的 OD600 值，以及联合处理下 PA-1 的 MIC90 值；48h 内不同处理组的细菌生长曲线，以及基于修正 Gompertz 模型计算的迟滞期、最大比生长速率 μmax、最大 OD600 值等生长参数。

数据来源：Fig. 1. The combined growth inhibitory and bactericidal activity of lactic acid and pediocin PA-1 against Aeromonas hydrophila.（A、B、C、D 子图）；Table 1 Interference of growth parameters of A. hydrophila ATCC 35654 by 3.5 mmol/L L-lactic acid and pediocin PA-1.；Table 2 Interference of growth parameters of A. hydrophila CICC 10500 by 3.5 mmol/L L-lactic acid and pediocin PA-1.

研究意义：证实单独 PA-1 对嗜水气单胞菌无明显生长抑制作用，单独 3.5mmol/L L - 乳酸仅有轻微抑菌效果，而二者联合具有显著的浓度依赖性协同抑菌活性；明确了联合处理下 PA-1 对两株菌的 MIC90 分别为 50μmol/L 和 30μmol/L；通过生长动力学参数，定量证实联合处理可显著延长细菌迟滞期、降低最大比生长速率和最大生物量，为整个研究奠定了核心表型基础。

② 嗜水气单胞菌致死率数据

数据内容：单独 PA-1、单独 L - 乳酸、二者联合处理 2h、4h、6h、8h 后，嗜水气单胞菌 ATCC 35654 和 CICC 10500 的死细胞比例（PI 染色流式细胞术检测）。

数据来源：Fig. 1. The combined growth inhibitory and bactericidal activity of lactic acid and pediocin PA-1 against Aeromonas hydrophila.（E、F 子图）

研究意义：证实单独 PA-1 处理 8h 细菌致死率低于 15%，单独 L - 乳酸处理致死率约 20%~32%，而二者联合处理 8h 致死率可达 62%~68%，明确了二者不仅具有协同抑菌活性，还具有显著的协同杀菌活性，排除了抑菌效果仅为细菌生长停滞的可能性，证实了该组合的杀菌效力。

③ 嗜水气单胞菌外膜 LPS 释放数据

数据内容：1~4mmol/L L - 乳酸处理 4h、8h 后，嗜水气单胞菌上清液的 190~210nm 全波长扫描结果，以及 ELISA 试剂盒定量检测的 LPS 释放量。

数据来源：Fig. 2. The release of LPS from A. hydrophila caused by lactic acid and the DNA and protein leakage from A. hydrophila caused by lactic acid, pediocin PA-1, or their combination.（A、B、C、D 子图）

研究意义：证实 L - 乳酸可浓度依赖性、时间依赖性地诱导嗜水气单胞菌外膜 LPS 释放，明确了 L - 乳酸对革兰氏阴性菌外膜的通透性破坏作用，揭示了 L - 乳酸协助 PA-1 突破外膜屏障的核心机制，为后续 PA-1 的细胞结合实验提供了直接依据。

④ FITC 标记 PA-1 在细菌细胞上的分布数据

数据内容：激光共聚焦显微镜拍摄的生理盐水预处理、3.5mmol/L L - 乳酸预处理 2h 和 4h 的嗜水气单胞菌，与 FITC-PA-1 孵育后的明场、FITC 荧光通道及合并图像。

数据来源：Fig. 3. Visualized distribution of pediocin PA-1 on/in A. hydrophila.

研究意义：直观证实未经乳酸处理的嗜水气单胞菌无法结合 PA-1，而乳酸预处理后的细菌可大量结合 PA-1，且结合量随预处理时间延长而增加，直接验证了 “L - 乳酸释放 LPS 后，PA-1 能够接触并结合到嗜水气单胞菌细胞上” 的核心假说，是协同作用机制的关键可视化证据。

⑤ 细菌跨膜电位与质子梯度的动态变化数据

数据内容：PA-1 处理后，生理盐水预处理、L - 乳酸预处理的嗜水气单胞菌，15min 内的 DisC3 (5) 荧光强度动态变化（反映跨膜电位 ΔΨ），以及 BCECF 荧光强度变化（反映质子梯度 ΔpH）。

数据来源：Fig. 4. Effect of pediocin PA-1 and L-lactic acid on the transmembrane potential and proton gradient of Aeromonas hydrophila cells.

研究意义：证实 PA-1 对未经乳酸处理的嗜水气单胞菌膜电位和质子梯度无影响，而可快速消散乳酸预处理细菌的跨膜电位 ΔΨ，明确了 PA-1 突破外膜屏障后，可作用于细菌内膜并消散质子动力势的关键组分，揭示了 PA-1 发挥杀菌作用的核心能量代谢机制。

⑥ 细菌胞内物质泄漏数据

数据内容：不同处理组 2h 内的胞外 ATP 水平动态变化；处理 12h 后上清液的 260nm（核酸）和 280nm（蛋白质）吸光度值。

数据来源：Fig. 5. Effects of lactic acid and pediocin PA-1 on the extracellular ATP and release of 260 nm and 280 nm absorbing substances from A. hydrophila.

研究意义：证实二者联合处理可导致嗜水气单胞菌胞内 ATP 快速、大量泄漏，且泄漏量显著高于单独乳酸处理组；同时联合处理可引发胞内核酸、蛋白质等大分子物质显著泄漏，从细胞膜通透性层面，证实了二者协同对细菌内膜的严重损伤，解释了协同杀菌效应的直接原因。

⑦ 细菌超微结构变化的显微成像数据

数据内容：对照组、单独乳酸处理组、单独 PA-1 处理组、联合处理组的嗜水气单胞菌扫描电镜（SEM）表面形貌图像，以及透射电镜（TEM）细胞内部超微结构图像。

数据来源：Fig. 6. Effects of lactic acid and pediocin PA-1 on the surface morphology and inner structure on A. hydrophila cells.

研究意义：直观展示了单独 PA-1 对细菌形态无明显影响，仅诱导少量细胞外囊泡形成；单独乳酸处理可导致细菌外膜轻微损伤、细胞变形；而二者联合处理可引发细菌严重皱缩塌陷、内外膜分离、内膜破损、细胞质泄漏甚至细胞裂解，从形态学层面直接证实了二者协同对细菌细胞膜和细胞结构的严重破坏，为整个协同机制提供了最直观的形态学证据。

8. 核心研究结论

① 本研究证实，IIa 类细菌素片球菌素 PA-1 与 L - 乳酸对革兰氏阴性致病菌嗜水气单胞菌具有显著的协同抑菌和杀菌活性，突破了 PA-1 仅对革兰氏阳性菌有抗菌活性的应用限制。

② 二者协同抑制嗜水气单胞菌的核心级联机制为：L - 乳酸首先破坏细菌外膜，诱导脂多糖 LPS 释放，打破革兰氏阴性菌的外膜屏障，使 PA-1 能够接触并结合到嗜水气单胞菌的细胞质膜上。③ 结合到质膜上的 PA-1 会快速消散细菌质子动力势（PMF）的核心组分跨膜电位 ΔΨ，同时显著增加细菌内外膜的通透性，导致胞内 ATP、核酸、蛋白质等生命活动关键物质大量泄漏。④ 二者联合处理可诱导嗜水气单胞菌发生严重的细胞形态和超微结构损伤，包括外膜囊泡形成、内外膜分离、内膜破损、细胞质泄漏，最终导致细菌裂解死亡。

⑤ 本研究揭示了乳酸菌的两种核心抗菌代谢产物（乳酸、细菌素）协同抗革兰氏阴性菌的作用机制，为细菌素和乳酸菌在水产养殖、食品保藏中防控嗜水气单胞菌等革兰氏阴性致病菌提供了重要的理论依据和全新的应用思路。

9. 芬兰 Bioscreen 仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义

本研究中，芬兰 Bioscreen C 全自动生长曲线分析仪是测定嗜水气单胞菌生长动态、验证乳酸与 PA-1 协同抑菌活性的核心工具，其测量的微生物生长曲线数据是整个研究的表型基础与核心前提，具体研究意义体现在以下 8 个维度：

① 实现了协同抑菌活性的动态、连续、精准定量表征

传统的终点 OD600 检测仅能获得单一时间点的细菌生长数据，无法反映培养周期内的生长动态变化。而芬兰 Bioscreen C 仪器可实现 48h 内的连续、自动化 OD600 检测，完整记录了不同处理组嗜水气单胞菌从迟滞期、对数期到稳定期的全周期生长过程，精准捕捉到了单独 PA-1 处理与对照组生长曲线几乎重合、单独乳酸处理仅轻微降低生长速率、联合处理组生长曲线显著下移的动态差异，从时间维度上完整、定量地验证了二者的协同抑菌效应，避免了终点检测可能造成的结果偏差与信息遗漏。

② 为协同抑菌效应提供了多维度的生长动力学定量证据

基于 Bioscreen C 测定的生长曲线数据，研究通过修正的 Gompertz 模型，提取并计算了迟滞期、最大比生长速率（μmax）、最大 OD600 值三个关键生长动力学参数，形成了 Table 1 和 Table 2 的定量数据。这些参数不仅定性证实了协同抑菌效应，还从三个维度定量解析了协同作用的模式：联合处理可显著延长细菌的生长迟滞期，且随 PA-1 浓度升高迟滞期延长越明显；显著降低细菌的最大比生长速率，抑制细菌的增殖能力；同时降低细菌的最大生物量，限制其最终生长水平。多参数的定量分析，让协同抑菌效应的验证从定性描述升级为精准的定量解析，大幅提升了实验结论的严谨性与科学性。

③ 消除了实验系统误差，确保了抑菌表型结果的可靠性与重复性

Bioscreen C 仪器可在完全一致的恒温、振荡培养条件下，同时平行检测多个处理组、多个重复样品的生长曲线，完全避免了人工取样、分批培养、环境波动带来的系统误差和操作误差。本研究中所有生长曲线实验均设置了 3 次生物学重复，仪器获得的平行样品数据具有极高的重复性，确保了观察到的生长差异确实来自于乳酸和 PA-1 的处理作用，而非实验操作或环境因素的干扰，为整个研究的核心表型结论提供了可靠的实验数据支撑。

④ 确定了机制研究的关键药物浓度，排除了实验结果的假阳性

通过 Bioscreen C 测定的生长曲线，研究明确了 3.5mmol/L L - 乳酸仅对嗜水气单胞菌有轻微生长抑制作用，50μmol/L PA-1 单独处理几乎不影响细菌生长，而二者联合则具有强协同抑菌效果。这一结果确定了后续所有机制实验（LPS 释放、激光共聚焦、膜电位检测、电镜观察等）的药物使用浓度 —— 即采用不显著影响细菌浮游生长的亚抑菌浓度，确保了后续实验中观察到的外膜损伤、膜电位消散、细胞结构破坏等效应，是药物的特异性作用机制导致，而非细菌生长被抑制的非特异性结果，排除了实验结果的假阳性，保障了机制研究的准确性。

⑤ 明确了协同抑菌效应的菌株特异性与浓度依赖性

Bioscreen C 的高通量检测能力，可同时平行测定两株不同来源的嗜水气单胞菌（ATCC 35654 和 CICC 10500）对不同浓度 PA-1 与乳酸联合处理的生长响应。结果显示，两株菌对联合处理的敏感性存在差异，ATCC 35654 的 MIC90 为 50μmol/L PA-1，CICC 10500 为 30μmol/L，证实了协同抑菌效应存在菌株特异性；同时，随着 PA-1 浓度从 10μmol/L 升高到 50μmol/L，细菌的生长抑制效果逐渐增强，明确了协同抑菌效应的 PA-1 浓度依赖性，为后续实际应用中复配浓度的优化提供了直接的实验依据。

⑥ 为后续杀菌活性实验提供了时间维度的参考依据

Bioscreen C 测定的生长曲线明确了嗜水气单胞菌的迟滞期、对数生长期、稳定期的时间节点，为后续 PI 染色流式细胞术的杀菌率实验，设置 2h、4h、6h、8h 的处理时间梯度提供了关键的时间参考，确保了杀菌率检测的时间点覆盖了细菌的主要生长阶段，能够准确反映不同处理时间下的协同杀菌效应，避免了时间点选择的盲目性。

⑦ 为乳酸菌代谢产物的实际应用提供了基础药效学数据

Bioscreen C 测定的生长曲线和动力学参数，是评估乳酸与 PA-1 作为生物抑菌剂实际应用潜力的核心基础药效学数据。迟滞期、最大比生长速率等参数，可直接用于指导水产品保鲜、水产养殖水体抑菌的实际应用中，药物的使用剂量、作用时间、添加频率等关键工艺参数的设计，大幅缩短了从实验室基础研究到实际应用转化的研发周期。

⑧ 为天然抗菌物质的协同效应评价提供了标准化实验方法

本研究中基于 Bioscreen C 生长曲线的协同抑菌评价方法，具有高通量、自动化、高重复性、动态定量的优势，可作为标准化的实验方法，用于后续其他细菌素、有机酸、植物精油等天然抗菌物质的协同抗菌效应筛选与评价，为革兰氏阴性菌绿色防控物质的高通量筛选提供了可靠的技术方案。