Antibiofilm potential of lactobionic acid against Salmonella Typhimurium
乳糖酸对鼠伤寒沙门氏菌的抗生物被膜潜力
来源：LWT - Food Science and Technology 162 (2022) 113461
1.摘要
本研究旨在探究乳糖酸（LBA）对鼠伤寒沙门氏菌的抗生物被膜活性及潜在作用机制。结果显示，乳糖酸对鼠伤寒沙门氏菌的最小抑菌浓度（MIC）为8 mg/mL；在亚抑菌浓度（SICs）下，显微镜观察结果证实乳糖酸可抑制鼠伤寒沙门氏菌在玻璃表面的生物被膜形成，结晶紫染色法与菌落计数法进一步证实其对不锈钢表面的生物被膜形成同样具有抑制效果。此外，乳糖酸可抑制鼠伤寒沙门氏菌的游动和群集运动能力，减少生物被膜形成过程中胞外多糖与胞外蛋白的产生。逆转录实时荧光定量PCR（RT-qPCR）分析显示，乳糖酸可下调鼠伤寒沙门氏菌中生物被膜形成相关基因的表达。上述数据表明，乳糖酸可通过干扰细菌运动、胞外多糖与蛋白的产生，以及生物被膜相关基因的表达，发挥对鼠伤寒沙门氏菌生物被膜形成的抑制作用。此外，4倍MIC（4MIC）和8倍MIC（8MIC）浓度的乳糖酸，可有效灭活不锈钢表面与鸡肉表面已形成的鼠伤寒沙门氏菌生物被膜。
2.关键词
Lactobionic acid、S. Typhimurium、Biofilm formation、Gene expression；中文翻译：乳糖酸、鼠伤寒沙门氏菌、生物被膜形成、基因表达
3.研究目的
填补乳糖酸针对食源性致病菌鼠伤寒沙门氏菌抗生物被膜活性的研究空白，系统探究乳糖酸对鼠伤寒沙门氏菌生物被膜形成的抑制作用及潜在分子机制；评估乳糖酸在食品工业典型接触表面（不锈钢）与真实食品基质（鸡肉）中，对已形成的鼠伤寒沙门氏菌成熟生物被膜的灭活效果；最终为食品工业开发新型、安全的沙门氏菌生物被膜防控制剂提供理论依据与实验支撑。
4.研究思路
第一步，通过微量肉汤稀释法测定乳糖酸对两株鼠伤寒沙门氏菌的最小抑菌浓度（MIC）与最小杀菌浓度（MBC），明确其基础抑菌活性；
第二步，使用芬兰Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪，测定不同浓度乳糖酸对鼠伤寒沙门氏菌24h内生长的影响，精准界定不影响菌株正常生长的亚抑菌浓度（SICs），为后续抗生物被膜实验设置合理的浓度梯度；
第三步，通过结晶紫染色定量、光学显微镜观察、场发射扫描电镜（FESEM）超微结构观察、激光共聚焦显微镜（CLSM）活菌荧光成像，从定量到定性、从宏观到微观，多维度验证亚抑菌浓度乳糖酸对玻璃表面鼠伤寒沙门氏菌生物被膜形成的抑制作用；
第四步，通过结晶紫染色与菌落计数法，评估亚抑菌浓度乳糖酸对食品工业核心接触材料不锈钢表面的鼠伤寒沙门氏菌生物被膜形成的抑制效果，验证其实际应用场景的有效性；
第五步，从表型层面解析乳糖酸的抗生物被膜机制，通过半固体琼脂平板实验测定其对沙门氏菌游动、群集运动能力的影响，通过苯酚-硫酸法与BCA法分别测定其对生物被膜胞外基质中多糖、蛋白产量的影响；
第六步，从分子层面解析作用机制，通过RT-qPCR技术，分析亚抑菌浓度乳糖酸对沙门氏菌鞭毛合成、胞外基质分泌、生物被膜调控相关关键基因转录水平的影响；
第七步，评估高浓度乳糖酸的成熟生物被膜灭活能力，测定4MIC、8MIC浓度的乳糖酸在不同处理时间下，对不锈钢表面与鸡肉表面已形成的成熟沙门氏菌生物被膜的活菌灭活效果；
最后，整合全链条实验结果，系统解析乳糖酸抗沙门氏菌生物被膜的多维度作用机制，评估其在食品工业中的应用潜力，形成最终研究结论。
5.研究亮点
首次系统揭示了食品级天然有机酸乳糖酸对鼠伤寒沙门氏菌的抗生物被膜活性，填补了该领域的研究空白，拓展了乳糖酸在食品防腐与食源性致病菌安全防控领域的应用边界。
证实亚抑菌浓度下乳糖酸即可发挥显著的生物被膜抑制效果，避免了高浓度抑菌剂使用带来的食品风味质构改变、致病菌耐药性诱导等风险，为食品工业中低剂量、安全防控致病菌生物被膜提供了全新方案。
从“表型-基质-分子”全维度解析了乳糖酸的抗生物被膜作用机制，证实其可通过抑制细菌鞭毛运动、减少胞外多糖与蛋白合成、下调生物被膜相关关键基因表达，多靶点协同抑制沙门氏菌生物被膜形成，机制解析系统且深入。
验证了乳糖酸兼具“预防+清除”双重作用，不仅能抑制沙门氏菌生物被膜的形成，还能有效灭活食品接触表面（不锈钢）和真实生鲜食品基质（鸡肉）中已形成的成熟生物被膜，具备食品工业实际应用的核心价值。
选用的乳糖酸天然存在于发酵乳制品中，兼具高水溶性、益生元活性、抗氧化、钙螯合等多种有益特性，相比传统化学消毒剂与抗生素，食品安全性更高，与高水分食品体系的适配性更强，应用场景更广泛。
6.可延伸的方向
探究乳糖酸与其他食品级抑菌剂（如乳酸、过氧乙酸、乳酸链球菌素、植物精油）或物理杀菌技术（如紫外-C、超声波、低温等离子体）的协同抗生物被膜效果，开发复合抑菌体系，降低使用剂量、提升灭活效率，适配不同食品加工与保鲜场景。
深入解析乳糖酸调控鼠伤寒沙门氏菌生物被膜形成的核心分子靶点与信号通路，明确其与关键调控蛋白、基因的直接互作机制，进一步完善乳糖酸抗生物被膜的分子作用网络。
评估乳糖酸在蛋液、生鲜蔬菜、乳制品、水产品等更多食品基质中，对沙门氏菌及单增李斯特菌、致病性大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等其他常见食源性致病菌生物被膜的防控效果，拓展其抗菌谱与应用范围。
开发乳糖酸的微胶囊、可食性膜/涂层等递送体系，提升其在食品表面的附着性、缓释性与环境稳定性，延长抑菌时效，开发适配生鲜食品保鲜、食品加工设备消毒的应用型产品。
开展动物体内实验，评估乳糖酸对沙门氏菌肠道感染的防控效果，同时验证其在动物体内的生物安全性、肠道菌群调节作用，为其在畜禽养殖、生鲜食品源头污染防控中的应用提供体内数据支撑。
探究长期亚抑菌浓度乳糖酸暴露下，鼠伤寒沙门氏菌的耐药性发展风险，评估其耐药突变频率与交叉耐药性，为其在食品工业中的长期安全应用提供数据保障。
开展中试规模的食品生产线应用验证，评估乳糖酸在食品加工设备原位清洗（CIP）、生鲜鸡肉冷链保鲜中的实际防控效果，优化应用工艺参数，推进其产业化落地。
7.测量的数据及研究意义（标注原文对应图表）
乳糖酸对鼠伤寒沙门氏菌14028™和CMCC 50115菌株的最小抑菌浓度（MIC）、最小杀菌浓度（MBC）数值，其中两株菌的MIC均为8 mg/mL，MBC均为16 mg/mL。研究意义：明确了乳糖酸对鼠伤寒沙门氏菌的基础抑菌活性，为后续亚抑菌浓度的界定、抗生物被膜实验的浓度梯度设置提供了核心基准数据。
不同浓度乳糖酸（1/32MIC~1MIC）处理下，鼠伤寒沙门氏菌24h内的生长曲线OD600nm连续检测数据，来自Fig. 1A。研究意义：完整揭示了乳糖酸对沙门氏菌生长的剂量-效应关系，精准界定了1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC为不影响菌株正常生长的亚抑菌浓度，确保后续抗生物被膜实验中观察到的效应是乳糖酸的特异性抗生物被膜作用，而非细菌生长受抑制的间接结果，从实验设计源头保障了研究的逻辑严谨性。
不同亚抑菌浓度乳糖酸处理后，鼠伤寒沙门氏菌生物被膜的结晶紫染色OD570nm定量数据，来自Fig. 1B。研究意义：首次定量证实了亚抑菌浓度下乳糖酸可浓度依赖性抑制鼠伤寒沙门氏菌的生物被膜形成，1/8MIC浓度下抑制率达24.3%，为乳糖酸的抗生物被膜活性提供了核心的定量证据。
不同亚抑菌浓度乳糖酸处理后，玻璃表面沙门氏菌生物被膜的400倍光学显微镜观察图像，来自Fig. 2A。研究意义：直观可视化地证实了乳糖酸处理后沙门氏菌生物被膜生物量显著减少、细菌黏附能力下降，从显微形态层面验证了结晶紫染色的定量结果，进一步支撑了乳糖酸的抗生物被膜活性。
不同亚抑菌浓度乳糖酸处理后，玻璃表面沙门氏菌生物被膜的场发射扫描电镜（FESEM）图像（2500倍、5000倍放大），来自Fig. 2B、Fig. 2C。研究意义：从超微结构层面揭示了乳糖酸对沙门氏菌生物被膜三维立体结构的破坏作用，证实其可浓度依赖性减少细菌聚集、瓦解多层致密的生物被膜结构，仅留下散在的单细胞或小型二维聚集体，明确了乳糖酸对生物被膜空间结构的抑制效应。
不同亚抑菌浓度乳糖酸处理后，玻璃表面沙门氏菌生物被膜的激光共聚焦显微镜（CLSM）活菌荧光成像图像，来自Fig. 2D。研究意义：通过活菌特异性荧光染色，直观证实了乳糖酸处理后生物被膜层变薄、活菌聚集体数量与规模显著下降，与FESEM结果形成互补，从活菌活性层面进一步验证了乳糖酸对生物被膜形成的强效抑制作用。
不同亚抑菌浓度乳糖酸处理后，不锈钢表面沙门氏菌生物被膜的结晶紫染色OD570nm定量数据，来自Fig. 3A。研究意义：证实了乳糖酸在食品工业最常用的304不锈钢接触表面，依然能浓度依赖性抑制沙门氏菌生物被膜形成，1/8MIC浓度下抑制率达33.5%，为乳糖酸在食品加工环境中的设备消毒、生物污染防控应用提供了直接的实验依据。
不同亚抑菌浓度乳糖酸处理后，不锈钢表面沙门氏菌生物被膜内的活菌菌落计数数据，来自Fig. 3B。研究意义：从活菌数量层面，定量证实了乳糖酸对不锈钢表面沙门氏菌生物被膜的抑制效果，1/8MIC浓度下可将生物被膜内活菌数从5.5×10⁵ CFU/mL降至1.4×10⁵ CFU/mL，与结晶紫染色结果相互印证，排除了染色法的假阳性干扰，数据更具说服力。
不同亚抑菌浓度乳糖酸处理后，沙门氏菌的游动、群集运动表型图像及运动半直径定量数据，来自Fig. 4A、Fig. 4B、Fig. 4C、Fig. 4D。研究意义：证实了亚抑菌浓度的乳糖酸可浓度依赖性显著抑制沙门氏菌鞭毛介导的游动和群集运动能力，而运动性是沙门氏菌实现表面初始黏附、启动生物被膜形成的关键前提，该结果从细菌黏附初始阶段，揭示了乳糖酸抑制生物被膜形成的核心表型机制。
不同亚抑菌浓度乳糖酸处理后，沙门氏菌生物被膜胞外基质中的多糖、蛋白产量定量数据，来自Fig. 5A、Fig. 5B。研究意义：证实了乳糖酸可浓度依赖性显著减少沙门氏菌生物被膜胞外多糖和蛋白的合成，而这两类物质是生物被膜胞外基质的核心组成，负责维持生物被膜的三维结构、机械稳定性与抗逆性，该结果从基质合成层面，解析了乳糖酸瓦解生物被膜结构的关键机制。
不同亚抑菌浓度乳糖酸处理后，沙门氏菌7个生物被膜相关关键基因（adrA、arcZ、csgD、csrB、sroC、fljB、flhD）的相对转录水平数据，来自Fig. 5C。研究意义：从分子层面证实了乳糖酸可浓度依赖性地下调沙门氏菌鞭毛合成、胞外基质分泌、生物被膜全局调控相关关键基因的表达，从转录调控层面揭示了乳糖酸抑制生物被膜形成的核心分子机制，完善了其作用通路的系统解析。
不同处理时间下，4MIC、8MIC浓度的乳糖酸对不锈钢表面成熟沙门氏菌生物被膜的灭活活菌计数数据，来自Fig. 6A。研究意义：证实了高浓度乳糖酸可时间-剂量依赖性灭活不锈钢表面已形成的成熟沙门氏菌生物被膜，8MIC处理240 min可使活菌数下降4.20 log CFU/mL，证实乳糖酸不仅能预防生物被膜形成，还能有效清除食品接触表面已形成的成熟生物被膜，具备食品加工环境消毒的实际应用价值。
不同处理时间下，4MIC、8MIC浓度的乳糖酸对鸡肉表面成熟沙门氏菌生物被膜的灭活活菌计数数据，来自Fig. 6B。研究意义：在真实生鲜食品基质中，验证了乳糖酸对鸡肉表面沙门氏菌成熟生物被膜的灭活效果，8MIC处理240 min可实现显著的活菌数下降，证实乳糖酸在生鲜畜禽肉的沙门氏菌污染防控中具备实际应用潜力，为其在食品保鲜、杀菌中的应用提供了核心的食品基质验证数据。
RT-qPCR实验所用的沙门氏菌内参基因、生物被膜相关基因的上下游引物序列信息，来自Table 1。研究意义：明确了本研究中基因表达检测的引物设计与序列信息，保障了RT-qPCR实验的可重复性，为后续相关研究中沙门氏菌生物被膜相关基因的转录水平检测提供了标准化的引物参考。
8.核心结论
乳糖酸对鼠伤寒沙门氏菌具有良好的抗生物被膜潜力。在亚抑菌浓度下，乳糖酸可有效抑制鼠伤寒沙门氏菌在玻璃和不锈钢表面的生物被膜形成。乳糖酸抑制鼠伤寒沙门氏菌生物被膜形成的核心机制为：抑制沙门氏菌的鞭毛运动能力、减少生物被膜胞外聚合物基质的产生、下调生物被膜形成相关关键基因的表达，多靶点协同发挥抗生物被膜作用。同时，4MIC和8MIC浓度的乳糖酸可有效灭活不锈钢表面和鸡肉表面已形成的鼠伤寒沙门氏菌成熟生物被膜。综上，乳糖酸具备作为鼠伤寒沙门氏菌抗生物被膜制剂的开发与应用潜力，但其在食品工业沙门氏菌生物被膜防控中的规模化应用，仍需进一步的研究验证。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰Labsystems公司的Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析系统，测定了0（空白对照）、1MIC、1/2MIC、1/4MIC、1/8MIC、1/16MIC、1/32MIC浓度的乳糖酸处理下，鼠伤寒沙门氏菌24h内的全周期生长动态，实验设置37℃恒温培养，每1小时自动读取OD600nm数值，每个组别设置独立生物学重复。该仪器测得的生长曲线数据，是本研究的核心基础数据，其研究意义可分为以下5个维度详细解读：
第一，精准界定了乳糖酸的亚抑菌浓度（SICs），为整个抗生物被膜机制研究奠定了核心实验基础。传统的试管静置培养、手动分光光度计取样检测法，仅能获取离散时间点的OD值，无法完整捕捉细菌从延滞期、指数生长期到稳定期的全周期生长变化，极易出现亚抑菌浓度界定的偏差，导致后续实验结果出现假阳性。而Bioscreen C仪器每1小时一次的全自动连续原位检测，完整描绘了不同浓度乳糖酸处理下沙门氏菌的全周期生长曲线，精准区分了不同浓度乳糖酸对菌株生长的差异化影响：1MIC可完全抑制沙门氏菌24h内的生长，1/2MIC和1/4MIC不会完全抑制菌株生长，但会显著降低其生长速率、延迟指数生长期的出现，而1/8MIC~1/32MIC浓度下，菌株的生长曲线与空白对照组无显著差异，由此精准界定了这三个浓度为乳糖酸的亚抑菌浓度。这一精准界定，确保了后续所有抗生物被膜实验中，观察到的沙门氏菌生物被膜形成减少、运动能力下降、胞外基质合成受阻、基因表达下调等表型，均是乳糖酸的特异性抗毒力/抗生物被膜效应直接导致，而非细菌生长被抑制的间接结果，从实验设计源头避免了结果的假阳性解读，保障了整个研究的逻辑严谨性与核心结论的科学性。
第二，高分辨率、全周期的生长动力学数据，完整揭示了乳糖酸对沙门氏菌生长的剂量-效应关系。Bioscreen C的高频连续检测，完整捕捉了不同浓度乳糖酸对沙门氏菌生长的全维度影响，不仅明确了MIC值，还清晰展现了亚-MIC浓度下乳糖酸对菌株生长速率、延滞期时长、最大生物量的细微影响，这些细节是传统离散取样法难以捕捉的。该剂量-效应关系的完整解析，不仅为后续实验的浓度梯度设置提供了精准依据，也为食品工业中乳糖酸的应用场景设计提供了核心参考：既可以选择亚抑菌浓度实现食品加工、储存过程中沙门氏菌生物被膜的长效防控，避免高剂量使用带来的食品感官品质改变与致病菌耐药性风险；也可以选择MIC及以上浓度，实现食品加工设备、生鲜食品表面沙门氏菌的快速杀菌，适配不同的食品工业场景需求。
第三，高通量、多平行的同步培养与检测，保障了生长曲线数据的可靠性与统计学效力。Bioscreen C仪器支持100孔蜂窝板的同步恒温培养与原位吸光度检测，本研究中通过该仪器同时完成了7个乳糖酸浓度梯度、多个生物学重复的生长曲线同步测定，完全消除了传统摇瓶分批培养中，温度、振荡幅度、培养时间、取样操作等环境因素的批次间波动带来的系统误差，确保了不同浓度组间生长表型对比的公平性与准确性。同时，多个生物学重复的平行测定，为数据的统计学分析提供了充足的样本量，保障了“1/8MIC~1/32MIC为乳糖酸的亚抑菌浓度”这一核心结论的可重复性与统计学显著性。
第四，标准化的检测体系，为研究结果的学术可比性与行业应用转化提供了通用基准。Bioscreen C是微生物生长动力学、抗菌剂活性检测领域的国际通用商用标准设备，在食品微生物、新型抑菌剂研发领域被广泛认可与使用。本研究采用该仪器获得的生长曲线数据，采用了标准化的培养温度、检测波长、读数频率与实验体系，可在不同实验室间进行重复、对比与验证，大幅提升了研究数据的学术价值。同时，该标准化的生长动力学数据，也为食品行业中乳糖酸作为食品添加剂、抑菌剂的使用剂量制定、抑菌效价评估提供了可参考的标准化实验数据，便于行业内的应用转化与效果对标。
第五，为乳糖酸的抗菌作用模式与机制解析提供了基础线索。通过Bioscreen C获得的全周期生长曲线，明确了乳糖酸对沙门氏菌的核心作用是浓度依赖性的生长抑制，而非快速的杀菌作用，这一特性也与后续MBC测定结果（MBC为16mg/mL，是MIC的2倍）形成了相互印证。这一基础作用模式的明确，为后续其抗菌、抗生物被膜机制的深入研究指明了核心方向：相较于破坏细菌细胞膜的快速杀菌剂，乳糖酸更倾向于通过调控细菌的毒力相关通路、生物被膜合成代谢来发挥作用，这也与后续的运动性抑制、胞外基质合成减少、生物被膜相关基因下调的实验结果形成了完整的逻辑闭环，完善了对乳糖酸抗菌、抗生物被膜作用模式的整体认知。