全自动生长曲线分析仪

Auxin-mediated regulation of susceptibility to toxic metabolites, c-di-GMP levels, and phage infection in the rhizobacterium Serratia plymuthica

生长素介导的根际细菌普城沙雷氏菌（Serratia plymuthica）对有毒代谢物的敏感性、环二鸟苷酸水平及噬菌体感染的调控

来源：July 2024 Volume 9 Issue 7 10.1128/msystems.00165-24

1. 论文摘要

植物与其微生物群之间的信息交流高度动态，涉及复杂的信号分子网络。其中，生长素吲哚 - 3 - 乙酸（IAA）是关键的植物激素，不仅调控植物的生长发育，还逐渐成为重要的跨界和种内信号分子，调控细菌在与植物宿主互作过程中的多个关键生理过程，但其对应的信号级联机制仍尚不明确。本研究深入解析了 IAA 在植物共生细菌中发挥调控功能的未知分子机制，填补了相关领域的研究空白。研究发现，IAA 可引起根际细菌普城沙雷氏菌（Serratia plymuthica）的全局转录组发生显著改变，多学科研究手段证实，IAA 的信号感知会干扰氨基酸、4 - 羟基苯甲酸等其他关键植物源信号介导的信号通路。IAA 处理会导致氨基酸代谢相关基因的转录水平发生大幅改变，进而引发显著的代谢重编程；同时，IAA 可通过诱导 AaeXAB 外排泵的表达，提升细菌对有毒芳香族化合物的抗性，而该外排泵同时也赋予了细菌对 IAA 自身的抗性。此外，IAA 可促进细菌运动能力，同时显著抑制生物膜形成，该表型与胞内环二鸟苷酸（c-di-GMP）水平的降低及荚膜多糖合成的改变相关。IAA 会上调荚膜合成相关基因的表达，进而增强细菌对荚膜依赖型噬菌体的感染敏感性。不仅如此，IAA 还可诱导多个抗生素抗性相关基因的表达，改变细菌对不同作用机制抗生素的敏感性与响应模式。综上，本研究揭示了植物共生细菌中 IAA 介导信号调控的复杂性，为根际细菌 - 植物互作机制研究提供了全新见解。

2. 论文关键词

细菌、转录组学、信号传导、生长素、生物膜、环二鸟苷酸、抗生素敏感性、噬菌体敏感性、吲哚 - 3 - 乙酸、有毒代谢物抗性

3. 研究目的

① 系统解析植物激素吲哚 - 3 - 乙酸（IAA）在根际生防细菌普城沙雷氏菌 A153 中的全局转录调控效应，明确 IAA 响应的核心基因与功能通路，填补植物相关细菌中 IAA 信号传导机制的研究空白。

② 揭示 IAA 对普城沙雷氏菌初级与次级代谢、运动能力、生物膜形成、有毒代谢物抗性、抗生素敏感性、噬菌体感染效率的调控作用及表型效应，明确 IAA 介导的根际细菌生理表型重编程规律。③ 解析 IAA 调控上述生理过程的核心分子机制，包括 IAA 对 c-di-GMP 第二信使信号通路、外排泵表达、转录调控因子、荚膜多糖合成的调控机制，阐明 IAA 与其他植物源信号分子之间的信号交叉对话。④ 鉴定新型的 IAA 结合型转录调控因子，明确其配体结合特性与调控功能，丰富细菌中 IAA 信号感知与传导的分子元件库。

⑤ 阐明 IAA 介导的调控作用在根际细菌生态适应、植物 - 微生物互作中的生物学意义，为 IAA 在生物技术、合成生物学、临床抗耐药菌及噬菌体治疗中的应用提供理论依据。

4. 研究思路

① 转录组学全局分析，锁定 IAA 响应核心通路：以不具备 IAA 分解代谢能力的普城沙雷氏菌 A153 为研究模型，在不影响菌株生长的 0.25 mM 和 1 mM IAA 处理条件下，于安德里霉素生物合成基因簇表达峰值的稳定期初期取样，通过 RNA-seq 测序分析 IAA 处理后的全基因组差异表达基因（DEGs）与小 RNA（sRNA），并通过 COG 功能分类明确 IAA 调控的核心功能类别，同时利用 RT-qPCR 验证转录组数据的可靠性。

② 代谢表型高通量筛选，验证转录组的功能效应：基于转录组中氨基酸、有机酸代谢相关基因的显著差异表达，利用 Biolog 表型芯片 PM1（碳源）和 PM3B（氮源），结合 Bioscreen 全自动生长曲线分析仪，系统分析 IAA 对菌株利用 95 种碳源、95 种氮源能力的影响，同时验证 IAA 对菌株在玉米根系分泌物中生长的调控作用，明确 IAA 介导的代谢重编程效应。③ 有毒代谢物抗性机制解析：针对转录组中上调最显著的 AaeXAB 外排泵编码基因，通过基因敲除构建 ΔaaeAB 突变体，结合 Bioscreen 生长曲线测定、最小抑菌浓度（MIC）分析，验证该外排泵对 4 - 羟基苯甲酸（4HBA）和高浓度 IAA 的抗性调控作用；同时尝试鉴定调控该操纵子的转录因子 AaeR 的配体，解析 IAA 对该外排泵的调控机制。④ 抗生素抗性表型与机制分析：基于转录组中多个抗生素抗性相关基因的差异表达，通过 MIC 测定、固体培养基抗性平板实验、生长曲线监测、抗生素耐受性实验，系统分析 IAA 对不同作用机制抗生素的敏感性、抗性及耐受性的调控效应，明确 IAA 对抗生素响应的调控规律。⑤ 运动 - 生物膜转换的调控机制解析：针对转录组中 c-di-GMP 周转、运动相关基因的差异表达，通过游泳运动实验、生物膜形成实验，验证 IAA 对菌株运动和生物膜形成的表型效应；利用 LC-MS/MS 定量胞内 c-di-GMP 水平，结合荚膜多糖（CPS）合成基因敲除突变体的表型验证，明确 IAA 通过下调 c-di-GMP 水平、调控 CPS 合成介导运动 - 生物膜转换的分子机制。⑥ 噬菌体感染敏感性的调控分析：基于 CPS 是噬菌体 ΦMAM1 的受体，且 IAA 上调 CPS 合成基因的表达，通过噬菌体吸附实验，验证 IAA 对噬菌体吸附效率、感染敏感性的调控作用，明确 IAA 在细菌 - 噬菌体互作中的功能。⑦ 新型 IAA 感应转录调控因子的鉴定：从 IAA 响应的转录调控因子中，筛选并鉴定出 TrpR_A153，通过蛋白异源表达纯化、等温滴定量热法（ITC）、竞争性结合实验，明确其对 IAA、吲哚 - 3 - 丙酮酸（IPA）、L - 色氨酸的结合特性，解析其配体竞争结合机制，完成 IAA 信号感知元件的鉴定。

⑧ 机制整合与生物学意义总结：整合所有实验结果，阐明 IAA 在根际细菌中多维度、多通路的调控网络，总结 IAA 介导的信号传导在植物 - 微生物互作、根际生态适应中的生物学意义，并提出未来的研究方向与应用前景。

5. 研究亮点

① 首次揭示了 IAA 对细菌第二信使 c-di-GMP 的调控作用：明确 IAA 可浓度依赖性地降低普城沙雷氏菌胞内 c-di-GMP 水平，进而介导细菌运动能力提升与生物膜形成抑制，填补了 IAA 信号与细菌 c-di-GMP 信号通路交叉调控的研究空白。

② 发现了新型的 IAA 解毒与抗性机制：鉴定出 AaeXAB 外排泵是细菌应对高浓度 IAA 毒性的核心元件，该泵同时介导对植物源信号分子 4HBA 和 IAA 的外排与抗性，揭示了 IAA 与 4HBA 两种植物源信号之间的信号交叉对话，同时发现了细菌中除分解代谢、结合失活外的第三种 IAA 稳态调控机制。③ 首次阐明了 IAA 对细菌噬菌体感染敏感性的调控作用：证实 IAA 可通过上调荚膜多糖合成基因的表达，显著提升荚膜依赖型噬菌体 ΦMAM1 的吸附效率与感染敏感性，揭示了植物激素在细菌 - 噬菌体互作中的全新功能，为噬菌体治疗的增效策略提供了新方向。④ 系统解析了 IAA 对根际细菌的全局转录与代谢调控网络：明确 IAA 可调控普城沙雷氏菌 13.2% 的基因表达，核心影响氨基酸代谢、碳水化合物代谢、能量产生、转录调控、膜生物合成等多个通路，同时显著改变菌株对根系分泌物中核心营养物质的利用能力，全面揭示了 IAA 在根际细菌生理代谢中的多效调控作用。⑤ 鉴定了新型的 IAA 结合型转录调控因子 TrpR_A153：明确该转录因子可同时结合 L - 色氨酸、IAA 和 IPA，且三种配体之间存在竞争性结合关系，是目前普城沙雷氏菌中发现的第二个 IAA 感应转录调控因子，丰富了细菌中 IAA 信号感知的分子元件库，为植物 - 细菌跨界信号交流的机制研究提供了新模型。⑥ 明确了 IAA 对细菌抗生素敏感性的差异化调控效应：证实 IAA 可显著提升菌株对氨苄青霉素、庆大霉素、卡那霉素等抗生素的抗性，同时降低对利福平的敏感性，揭示了 IAA 对抗生素响应的差异化调控规律，为临床耐药菌防控、抗生素佐剂开发提供了新的理论依据。

⑦ 建立了无 IAA 分解代谢干扰的理想研究模型：利用不具备 IAA 分解代谢能力的普城沙雷氏菌 A153 为研究对象，完全排除了 IAA 分解代谢对信号调控研究的干扰，精准解析了 IAA 作为信号分子的纯调控效应，研究结果更具可靠性与说服力。

6. 可延伸的研究方向

① IAA 调控 c-di-GMP 水平的具体分子机制解析：鉴定 IAA 信号通路中直接调控 c-di-GMP 合成与降解的鸟苷酸环化酶、磷酸二酯酶，明确 IAA 信号调控这些酶活性或表达的具体分子通路，解析 IAA 与 c-di-GMP 信号网络交叉调控的完整级联反应。

② AaeXAB 外排泵的功能与调控机制深入研究：验证 AaeXAB 外排泵对 IAA 的直接外排功能，解析其底物识别谱；鉴定调控 aaeXAB 操纵子表达的转录因子 AaeR 的天然配体，明确 IAA 诱导该外排泵表达的具体转录调控机制。③ TrpR_A153 的全基因组调控靶标与生物学功能解析：通过 ChIP-seq、转录组测序等手段，鉴定 TrpR_A153 的全基因组结合位点与调控靶基因，明确其在 IAA 信号传导、氨基酸代谢、抗生素抗性等通路中的具体调控功能，解析其在植物 - 细菌互作中的生物学意义。④ IAA 介导的调控作用在根际微生态中的原位功能验证：在植物根际原位环境中，验证 IAA 对普城沙雷氏菌根际定殖能力、生防活性、微生物群落互作的调控作用，明确 IAA 信号在植物 - 微生物共生体系中的生态功能与进化意义。⑤ IAA 在抗细菌耐药性中的应用研究：基于 IAA 对抗生素抗性的差异化调控效应，开发以 IAA 或其拮抗剂为核心的抗生素佐剂，探索其在多重耐药菌感染治疗中的应用潜力；同时解析 IAA 调控抗生素抗性的具体分子机制，为抗耐药策略开发提供新靶点。⑥ IAA 在噬菌体治疗中的增效应用研究：基于 IAA 可提升噬菌体吸附与感染效率的发现，探索 IAA 作为噬菌体治疗增效剂的应用潜力，优化其在临床耐药菌感染、农业植物病原菌防控中的应用方案。⑦ 植物 - 细菌跨界 IAA 信号交流的普适性研究：在其他植物共生细菌、植物病原菌中，验证本研究发现的 IAA 调控机制的普适性，解析不同细菌中 IAA 信号通路的进化规律，揭示植物 - 微生物跨界信号交流的通用分子机制。

⑧ IAA 调控细菌次级代谢的机制研究：基于 IAA 对安德里霉素生物合成的抑制效应，解析 IAA 调控抗生素等次级代谢产物合成的具体分子机制，探索通过 IAA 信号调控微生物天然产物合成的合成生物学应用策略。

7. 测量的数据、对应图表及研究意义

① 安德里霉素生物合成基因簇的转录动态、IAA 处理下的安德里霉素产生能力数据

数据内容：安德里霉素生物合成基因簇的转录水平随生长时间的变化曲线；0、0.25 mM、1 mM IAA 处理下，普城沙雷氏菌 A153 的安德里霉素抑菌活性。

数据来源：FIG 1 The expression profile of the andrimid biosynthetic gene cluster of Serratia plymuthica A153 and sample collection for the transcriptomics assays. (A) Transcription of the andrimid biosynthetic cluster measured from a chromosomal fusion admK::lacZ in S. plymuthica A153; (B) Andrimid production by S. plymuthica A153 under the experimental conditions in which RNA-seq samples were taken.

研究意义：明确了 RNA-seq 取样的最佳时间点（稳定期初期），证实了 IAA 可浓度依赖性地抑制安德里霉素的生物合成，为后续转录组分析提供了实验基础，同时初步验证了 IAA 对细菌次级代谢的调控作用。

② IAA 处理后的全基因组转录组差异表达数据

数据内容：0.25 mM、1 mM IAA 处理下的差异表达基因（DEGs）热图、韦恩图、火山图；DEGs 的 COG 功能分类统计；IAA 响应的 sRNA 差异表达数据；14 个 DEGs 的 RT-qPCR 验证数据。

数据来源：FIG 2 The transcriptome of Serratia plymuthica A153 in response to indole-3-acetic acid (IAA). (A) Heatmaps derived from A153 growth in minimal medium supplemented with 15 mM glucose in the absence and presence of 0.25 and 1 mM IAA; (B) Venn diagram showing the number of differentially expressed genes in the presence of 0.25 mM and 1 mM IAA; (C) Volcano plot of differentially transcribed genes in response to 1 mM IAA; (D) Functional classification of the differentially regulated genes in response to 1 mM IAA.；Table S1 Genes modulated by the addition of 1 mM IAA；Table S2 Genes modulated by the addition of 0.25 mM IAA；Table S3 Common genes modulated by the addition of 0.25 and 1 mM IAA；Table S4 sRNAs identified in transcriptional analysis in response to 0.25 and 1 mM IAA；Fig. S3 RT-qPCR validation of RNA-seq data。

研究意义：全局揭示了 IAA 对普城沙雷氏菌转录组的浓度依赖性调控效应，明确了 IAA 响应的核心基因与功能通路，证实了 IAA 主要调控氨基酸代谢、碳水化合物代谢、转录调控、膜生物合成等核心生理过程；同时鉴定了大量 IAA 响应的 sRNA，为后续机制解析提供了全局的转录组数据支撑，RT-qPCR 验证了转录组数据的可靠性。

③ IAA 对菌株碳源、氮源利用能力的调控数据

数据内容：1 mM IAA 处理下，菌株对不同碳源、氮源的生长曲线；IAA 对菌株在玉米根系分泌物中生长的影响数据。

数据来源：FIG 3 Indole-3-acetic acid affects the metabolism of different nutrients as a sole carbon (A) and nitrogen (B) sources in Serratia plymuthica.；Table S5 Growth of Serratia plymuthica A153 in minimal medium with different nutrients as sole carbon and nitrogen sources；Fig. S4 Growth curves of A153 with different carbon sources in the absence and presence of 1 mM IAA；Fig. S5 Growth curves of A153 with different nitrogen sources in the absence and presence of 1 mM IAA；Fig. S6 Growth of A153 in maize root exudates in the absence and presence of 1 mM IAA。

研究意义：在表型层面验证了转录组的结果，证实 IAA 显著改变了菌株对 37% 的测试碳源、22% 的测试氮源的利用能力，核心影响氨基酸、有机酸的代谢，而这些物质是植物根系分泌物的核心组分；同时证实 IAA 可抑制菌株在玉米根系分泌物中的生长，揭示了 IAA 在根际营养环境适应中的关键调控作用。

④ AaeXAB 外排泵的表达与功能验证数据

数据内容：不同浓度 IAA 处理下 aaeX 基因的 RT-qPCR 表达水平；野生型与 ΔaaeAB 突变体在不同浓度 IAA、4HBA 处理下的生长曲线；野生型与 ΔaaeAB 突变体的 IAA、4HBA 最小抑菌浓度（MIC）数据。

数据来源：FIG 4 Indole-3-acetic acid (IAA) regulates the expression of the AaeXAB efflux pump to control resistance to high levels of IAA in Serratia plymuthica. (A) Impact of different IAA concentrations on aaeX transcript levels; (B) Growth kinetics of S. plymuthica A153 strains with different concentrations of IAA.；Table S6 MIC values of different compounds for S. plymuthica A153 wild-type and mutant strains；Fig. S7 Growth of wild-type A153 and ΔaaeAB mutant in the presence of 4HBA；Fig. S8 Effect of IAA on the growth of A153 in the presence of high 4HBA concentrations。

研究意义：证实了 IAA 可显著诱导 aaeXAB 操纵子的表达，明确了 AaeXAB 外排泵是细菌对 4HBA 和高浓度 IAA 产生抗性的核心元件，揭示了细菌应对 IAA 毒性的全新机制，同时证实了 IAA 与 4HBA 两种植物源信号之间的交叉调控关系。

⑤ IAA 对菌株抗生素抗性的调控数据

数据内容：IAA 处理下菌株对不同抗生素的 MIC 值；固体培养基中 IAA 处理下菌株对氨苄青霉素的抗性平板结果与存活率统计；IAA 处理下菌株在亚 MIC 浓度不同抗生素中的生长曲线；IAA 处理下菌株对高浓度抗生素的耐受性数据。

数据来源：FIG 5 Indole-3-acetic acid (IAA) increases ampicillin resistance in Serratia plymuthica. (A) Ampicillin (Ap) resistance of A153 in response to 1 mM IAA; (B) Quantification of survival cells (%) corresponding to Fig. 5A.；Table S6 MIC values of different compounds for S. plymuthica A153 wild-type and mutant strains；Fig. S9 Growth of A153 in the presence of different antibiotics in the absence and presence of 1 mM IAA。

研究意义：明确了 IAA 对不同作用机制抗生素的差异化调控效应，证实 IAA 可显著提升菌株对氨苄青霉素、庆大霉素、卡那霉素、萘啶酸、链霉素的抗性 / 生长能力，降低对利福平的敏感性，对氯霉素、四环素无显著影响；同时证实 IAA 不影响菌株的抗生素耐受性，揭示了 IAA 在细菌抗生素抗性调控中的重要作用，为耐药菌防控提供了新的研究方向。

⑥ IAA 对菌株运动、生物膜形成及 c-di-GMP 水平的调控数据

数据内容：不同浓度 IAA 处理下菌株的游泳运动表型与直径统计；不同浓度 IAA 处理下菌株的生物膜形成表型；野生型与 CPS 合成突变体在 IAA 处理下的生物膜形成表型；LC-MS/MS 定量的不同浓度 IAA 处理下菌株的胞内 c-di-GMP 水平。

数据来源：FIG 6 IAA treatment lowers c-di-GMP levels to promote motility and inhibit biofilm formation in Serratia plymuthica. (A) Swimming motility was examined in minimal medium supplemented with 15 mM glucose in the absence and presence of IAA; (B) Biofilm formation in borosilicate glass flasks; (C) Quantification of c-di-GMP levels in A153 by LC-MS/MS.

研究意义：证实了 IAA 可浓度依赖性地提升菌株的游泳运动能力，完全抑制生物膜形成；首次明确 IAA 可浓度依赖性地降低菌株胞内 c-di-GMP 水平，揭示了 IAA 调控运动 - 生物膜转换的核心分子机制；同时证实 CPS 合成是 IAA 抑制生物膜形成的必需条件，明确了 c-di-GMP-CPS 通路在 IAA 表型调控中的核心作用。

⑦ IAA 对噬菌体吸附效率的调控数据

数据内容：1 mM IAA 处理与未处理组中，噬菌体 ΦMAM1 在不同时间点的吸附效率曲线。

数据来源：FIG 7 IAA treatment promotes phage attachment to S. plymuthica A153. Shown are adsorption assays of ΦMAM1 to A153 in the absence and presence of 1 mM IAA.

研究意义：首次证实 IAA 可显著提升荚膜依赖型噬菌体的初始吸附效率，揭示了植物激素在细菌 - 噬菌体互作中的全新调控功能，证实 IAA 可通过上调 CPS 合成增强噬菌体感染敏感性，为噬菌体治疗的增效策略提供了理论依据。

⑧ TrpR_A153 的配体结合特性数据

数据内容：等温滴定量热法（ITC）检测的 TrpR_A153 与 L - 色氨酸、IAA、IPA 的结合曲线与解离常数（KD）；IAA、IPA 与 L - 色氨酸的竞争性结合 ITC 数据。

数据来源：FIG 8 Isothermal titration calorimetry studies of the binding of different ligands to TrpR_A153 of Serratia plymuthica A153.；Fig. S10 Competitive binding assays of different ligands to TrpR_A153。

研究意义：鉴定了新型的 IAA 结合型转录调控因子 TrpR_A153，明确了其对 L - 色氨酸、IAA、IPA 的结合亲和力，证实三种配体之间存在竞争性结合关系，揭示了 IAA 与氨基酸代谢之间的信号交叉对话，丰富了细菌中 IAA 信号感知的分子元件库。

8. 核心研究结论

① 植物生长素吲哚 - 3 - 乙酸（IAA）可对根际生防细菌普城沙雷氏菌 A153 的全局转录组产生浓度依赖性的显著调控效应，1 mM IAA 可调控菌株 13.2% 的编码基因与大量 sRNA 的表达，核心影响氨基酸代谢、碳水化合物代谢、能量产生与转换、转录调控、细胞壁 / 膜生物合成、信号传导等多个核心生理通路，引发菌株显著的代谢重编程。

② IAA 可显著改变普城沙雷氏菌对植物根系分泌物中核心营养物质的利用能力，主要影响氨基酸、有机酸的代谢利用，同时抑制菌株在玉米根系分泌物中的生长，揭示了 IAA 在根际细菌营养环境适应中的关键调控作用。③ IAA 可显著诱导 AaeXAB 外排泵的编码基因表达，该外排泵不仅是细菌应对植物源有毒芳香族化合物 4 - 羟基苯甲酸（4HBA）的核心元件，同时还赋予了细菌对高浓度 IAA 的抗性，是细菌中全新的 IAA 解毒与稳态调控机制，同时揭示了 IAA 与 4HBA 两种植物源信号之间的交叉调控。④ IAA 对普城沙雷氏菌的抗生素敏感性具有差异化调控效应，可显著提升菌株对氨苄青霉素、氨基糖苷类抗生素等的抗性，降低对利福平的敏感性，该效应与 IAA 诱导外排泵、β- 内酰胺酶、孔蛋白等抗性相关基因的表达相关，证实 IAA 是细菌抗生素抗性调控的重要信号分子。⑤ 首次发现 IAA 可浓度依赖性地降低普城沙雷氏菌胞内第二信使环二鸟苷酸（c-di-GMP）的水平，进而介导菌株游泳运动能力的提升与生物膜形成的显著抑制，且该生物膜抑制效应依赖于荚膜多糖（CPS）的合成，揭示了 IAA 信号与细菌 c-di-GMP 信号通路的交叉调控机制。⑥ IAA 可显著上调 CPS 合成相关基因的表达，进而显著提升以 CPS 为受体的噬菌体 ΦMAM1 的初始吸附效率与感染敏感性，首次证实植物激素可调控细菌对噬菌体的感染敏感性，为噬菌体治疗的增效应用提供了全新方向。⑦ 鉴定了新型的 IAA 结合型转录调控因子 TrpR_A153，该蛋白可同时结合 L - 色氨酸、IAA 及吲哚 - 3 - 丙酮酸（IPA），且三种配体之间存在竞争性结合关系，是普城沙雷氏菌中第二个被鉴定的 IAA 感应转录因子，揭示了 IAA 与氨基酸代谢之间的信号交叉对话，丰富了细菌中 IAA 信号感知的分子机制。

⑧ 本研究全面揭示了 IAA 在根际细菌中多维度、多通路的复杂调控网络，证实 IAA 不仅是植物 - 细菌互作的跨界信号分子，还可全面调控细菌的代谢、运动、生物膜形成、抗逆性、抗生素抗性、噬菌体互作等多个关键生理过程，为植物 - 微生物互作机制研究、微生物生物技术应用、临床抗耐药菌与噬菌体治疗提供了全新的理论依据与研究方向。

9. 芬兰 Bioscreen 仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义

本研究中，芬兰 Bioscreen C 全自动微生物生长分析仪是核心的表型分析工具，所有菌株的生长动力学、代谢表型筛选、基因功能验证、最小抑菌浓度（MIC）测定、IAA 的生理效应定量等核心实验的生长曲线数据，均由该仪器完成测定。其高通量、高重复性、高时间分辨率、精准控温与原位检测的特性，为本研究的核心发现提供了关键、可重复、定量化的表型数据支撑，具体研究意义体现在以下 10 个核心层面：

① 实现了 IAA 处理下菌株生长安全性的验证，为转录组实验奠定了基础

本研究首先通过 Bioscreen 仪器测定了 0.25 mM 和 1 mM IAA 处理下普城沙雷氏菌的生长曲线，证实这两个浓度的 IAA 不会影响菌株的生长速率与菌落形成能力，完全排除了 IAA 的细胞毒性对后续转录组、表型实验的干扰，确保了后续实验中观察到的基因表达与表型变化均是 IAA 的信号调控效应，而非毒性效应，为整个研究的实验设计提供了关键的前提验证。相关数据见Fig. S1。

② 完成了 95 种碳源、95 种氮源利用能力的高通量平行筛选，系统解析了 IAA 介导的代谢重编程

基于 Bioscreen 仪器的 100 孔板高通量检测能力，本研究完成了 Biolog PM1（95 种碳源）和 PM3B（95 种氮源）芯片的全部生长曲线测定，平行分析了 1 mM IAA 处理与对照组对近 200 种营养物质的利用能力，在短时间内完成了上百组生长实验的平行检测，明确了 IAA 对 37% 的测试碳源、22% 的测试氮源的代谢利用具有显著调控作用，核心影响氨基酸、有机酸的代谢，精准还原了 IAA 对菌株核心代谢通路的重编程效应。相关数据见Fig. 3、Table S5、Fig. S4、Fig. S5。

③ 实现了 AaeXAB 外排泵基因功能的精准验证，明确了其对 IAA 和 4HBA 的抗性调控作用

通过 Bioscreen 仪器，本研究平行测定了野生型 A153 与 ΔaaeAB 敲除突变体在不同浓度 IAA、4HBA 处理下的全周期生长曲线，精准量化了突变体与野生型的生长速率、最大生物量、迟滞期的差异，明确了 ΔaaeAB 突变体对 IAA 的 MIC 下降超 12 倍，对 4HBA 的抗性也显著下降，直接证实了 AaeXAB 外排泵是菌株对 IAA 和 4HBA 产生抗性的核心元件。相较于传统的终点法检测，Bioscreen 的全周期生长曲线可完整捕捉菌株在毒物胁迫下的生长动态，避免了终点法的信息遗漏，让基因功能的验证更精准、全面。相关数据见Fig. 4B、Fig. S7、Fig. S8、Table S6。

④ 完成了不同抗生素的最小抑菌浓度（MIC）精准测定，明确了 IAA 对抗生素抗性的调控效应

本研究通过 Bioscreen 仪器，采用二倍梯度稀释法，平行测定了 IAA 处理与对照组对 8 种不同作用机制抗生素的 MIC 值，同时监测了菌株在亚 MIC 浓度抗生素中的全周期生长动态，精准量化了 IAA 对不同抗生素抗性的调控幅度，明确了 IAA 可显著提升氨苄青霉素、庆大霉素、卡那霉素等抗生素的 MIC 值，同时降低菌株在利福平胁迫下的生长能力。Bioscreen 仪器的自动化、连续检测特性，避免了人工检测的主观误差，确保了 MIC 测定的准确性与可重复性，为 IAA 对抗生素抗性的差异化调控结论提供了核心的定量数据支撑。相关数据见Table S6、Fig. S9。

⑤ 实现了 IAA 对菌株在玉米根系分泌物中生长的调控效应验证，揭示了其根际生态适应意义

利用 Bioscreen 仪器，本研究精准测定了菌株在不同浓度玉米根系分泌物中，IAA 处理与对照组的生长曲线，明确了 IAA 可显著抑制菌株在根系分泌物中的生长能力。玉米根系分泌物是根际细菌的核心营养来源，该生长曲线数据直接证实了 IAA 可调控菌株对根际营养环境的适应能力，为 IAA 在植物 - 细菌根际互作中的生物学意义提供了直接的表型证据。相关数据见Fig. S6。

⑥ 实现了多组生物学重复的平行检测，确保了实验数据的统计学可靠性

本研究中所有 Bioscreen 生长实验均设置了 3-5 个生物学重复，仪器可在完全一致的培养条件（温度、震荡、检测参数）下，同时完成上百个样品的平行检测，完全消除了不同批次、不同培养环境带来的系统误差，确保了实验组与对照组的生长数据具有直接可比性，所有生长表型差异均通过统计学检验，让研究结论具备高度的可靠性与可重复性。

⑦ 捕捉了菌株生长的全周期动态变化，实现了 IAA 效应的多维度定量化解析

相较于传统的分光光度计终点法仅能获得单个时间点的 OD 值，Bioscreen 仪器可每 30 分钟完成一次全板检测，连续监测菌株 72 小时的生长动态，获得完整的生长曲线，进而提取迟滞期时长、对数期生长速率、最大生物量、生长效率等多个定量动力学参数。本研究通过这些参数，不仅定性描述了 IAA 对菌株生长的影响，还定量解析了 IAA 对不同营养物质利用效率、毒物胁迫抗性、抗生素响应的调控幅度，将研究结论从定性描述提升到了定量化解析的层面。

⑧ 实现了低生物量、弱生长表型的精准捕捉，发现了 IAA 的精细调控效应

Bioscreen 仪器具备极高的光学检测灵敏度，可精准捕捉菌株在单一碳 / 氮源、低浓度毒物胁迫下的微弱生长差异，这些差异往往无法通过传统的人工检测方法识别。本研究通过该仪器，发现了 IAA 对多种氨基酸、有机酸的利用具有精细的调控效应，包括对部分底物的生长促进、对部分底物的生长抑制，这些精细的表型差异为转录组数据的功能验证提供了关键支撑，也完整还原了 IAA 对代谢网络的复杂调控。

⑨ 为基因敲除突变体的表型验证提供了标准化的检测体系，确保了功能解析的准确性

本研究中 ΔaaeAB、CPS 合成基因敲除等多个突变体的功能验证，均通过 Bioscreen 仪器完成了生长表型的平行检测。仪器的标准化检测流程，确保了野生型与突变体的培养条件、检测参数完全一致，所有表型差异均来自于基因敲除本身，而非环境因素干扰，为基因功能的解析提供了严谨、标准化的实验证据，避免了传统摇瓶培养、人工检测带来的实验误差。

⑩ 为 IAA 介导的表型调控提供了直观、可量化的核心证据，支撑了研究的核心结论本研究的核心结论，包括 IAA 对代谢重编程、有毒代谢物抗性、抗生素抗性的调控，均直接基于 Bioscreen 仪器测定的生长曲线数据。这些连续、定量、可重复的生长数据，为每一个分子机制的解析提供了直观的表型支撑，让转录组层面的基因表达差异与表型层面的生理功能变化形成了完整的证据链，确保了研究结论的严谨性与科学性，是本研究所有表型分析的核心实验基础。