全自动生长曲线分析仪

Anti-biofilm and anti-virulence potential of cell free supernatant of Akkermansia muciniphila against Salmonella

嗜黏蛋白阿克曼菌无细胞上清液对沙门氏菌的抗生物被膜与抗毒力潜力

来源：J.x. Liu et al. / Food Science and Human Wellness 13 (2024) 2677-2689

1.摘要

嗜黏蛋白阿克曼菌是定植于哺乳动物肠道内、与宿主共进化的共生菌之一。大量研究证实了该菌在改善代谢紊乱中的有益作用，但其针对病原菌的抗菌潜力却鲜有报道。本研究探究了嗜黏蛋白阿克曼菌无细胞上清液（CFS）对鼠伤寒沙门氏菌的抗菌与抗毒力特性。结果显示，CFS可延缓鼠伤寒沙门氏菌SL1344与14028菌株的生长，同时抑制两株菌的运动能力；可剂量依赖性降低两株菌的细胞表面疏水性与自聚集能力，还能显著减弱其生物被膜形成能力。与未处理组相比，CFS处理后的沙门氏菌对Caco-2细胞的黏附与侵袭能力显著下降，在巨噬细胞内的胞内存活能力也明显降低。CFS的抗菌活性在高温与多种蛋白酶处理后仍能保持，但在pH中和后完全丧失。气相色谱-质谱联用（GC-MS）证实，嗜黏蛋白阿克曼菌可产生一定量的乙酸与丙酸；超高效液相色谱-质谱联用（UHPLC-MS）进一步鉴定出CFS中的其他有机酸与代谢产物。综上，嗜黏蛋白阿克曼菌的无细胞上清液对沙门氏菌具有抗生物被膜与抗毒力特性，在食品工业中可用于防控沙门氏菌污染、降低沙门氏菌感染风险，具备潜在的应用价值。

2.关键词

Akkermansia muciniphila、Salmonella、Biofilm、Motility、Short-chain fatty acid、Adhesion、Invasion；中文翻译：嗜黏蛋白阿克曼菌、沙门氏菌、生物被膜、运动性、短链脂肪酸、黏附、侵袭

3.研究目的

填补下一代益生菌嗜黏蛋白阿克曼菌对食源性致病菌作用机制的研究空白，系统探究该菌无细胞上清液（CFS）对沙门氏菌的抗菌、抗生物被膜与抗毒力特性；明确CFS中发挥抑菌抗毒力作用的潜在生物活性成分与理化特性；为食品工业中开发新型沙门氏菌污染防控制剂、预防沙门氏菌相关食源性感染提供理论依据与实验支撑。

4.研究思路

以嗜黏蛋白阿克曼菌标准株MucT（ATCC BAA-835）为研究对象，厌氧培养后离心、过滤制备无菌无细胞上清液（CFS），以鼠伤寒沙门氏菌SL1344、14028两株标准菌株为靶标菌，开展全链条实验验证：

第一步，通过芬兰Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪，测定不同浓度CFS对两株沙门氏菌36h内生长的影响，明确CFS的体外抑菌活性与剂量效应；

第二步，通过半固体琼脂平板运动性实验、二甲苯法疏水实验、静置法自聚集实验，探究CFS对沙门氏菌运动性、细胞表面疏水性、自聚集能力等毒力相关基础表型的影响；

第三步，通过结晶紫染色定量、扫描电镜形貌观察、SYTO9/PI活死菌荧光染色，从定量、微观结构、细菌活性三个维度，全面评估CFS对沙门氏菌生物被膜形成的抑制作用；

第四步，通过人结肠腺癌细胞Caco-2模型、小鼠巨噬细胞RAW264.7模型，验证CFS处理后沙门氏菌对肠道上皮细胞的黏附、侵袭能力，以及在巨噬细胞内的胞内存活与增殖能力的变化，同时设置pH中和对照组，明确酸性环境是否为抗黏附侵袭的唯一因素；

第五步，通过不同温度、pH中和、强酸强碱、多种蛋白酶处理CFS，测定处理后CFS的抑菌活性变化，明确其活性成分的理化稳定性与核心物质类别；

第六步，通过GC-MS定量检测CFS中的短链脂肪酸组成与含量，设置外添短链脂肪酸实验组验证其抑菌作用；通过UHPLC-MS/MS开展非靶向代谢组学分析，鉴定CFS中的差异代谢物、核心代谢物类别与关键差异代谢通路；

最后，整合所有实验结果，解析嗜黏蛋白阿克曼菌CFS抗沙门氏菌的作用机制，评估其在食品领域的应用潜力，形成最终研究结论。

5.研究亮点

首次系统解析了下一代益生菌嗜黏蛋白阿克曼菌的无细胞上清液对食源性致病菌沙门氏菌的全维度抗毒力活性，填补了该菌在食源性致病菌防控领域的研究空白，拓展了嗜黏蛋白阿克曼菌的益生功能边界。

明确了CFS抑菌抗毒力的核心物质基础为酸性代谢产物，尤其是乙酸、丙酸等短链脂肪酸，证实其活性具有耐高温、对多种蛋白酶不敏感的特性，为该制剂在食品热加工、复杂食品基质中的应用提供了关键的理化特性支撑。

从致病菌致病全链条揭示了CFS的作用机制，不仅能抑制沙门氏菌生长，还可阻断其运动、生物被膜形成、肠道上皮细胞黏附侵袭、巨噬细胞内存活增殖的完整致病过程，多维度抑制沙门氏菌的毒力与感染潜力。

证实了CFS对沙门氏菌黏附、侵袭的抑制效应并非仅依赖酸性环境，pH中和后的CFS仍能显著降低沙门氏菌的上皮细胞侵袭能力，揭示了其除有机酸外还存在其他抗毒力活性物质，为后续新型活性代谢物的挖掘提供了新方向。

通过GC-MS与UHPLC-MS/MS联合分析，全面鉴定了CFS的代谢物组成，明确了有机酸、脂质类、有机杂环化合物是三大核心代谢物类别，筛选出关键差异代谢通路，为后续活性单体的分离纯化与分子机制深研奠定了全维度的组学数据基础。

6.可延伸的方向

对CFS中的活性单体进行分离纯化，验证单一成分（如特定有机酸、脂质类代谢物）的抗沙门氏菌活性与构效关系，明确发挥抑菌抗毒力作用的核心效应分子。

探究CFS中胞外多糖（EPS）等大分子物质是否参与沙门氏菌抗黏附、抗生物被膜过程，解析其与有机酸的协同抑菌抗毒力机制，完善CFS的作用网络。

开展体内动物感染实验，验证嗜黏蛋白阿克曼菌活菌及其CFS在活体肠道内对沙门氏菌感染的防控效果，评估其体内安全性、定植能力与抗感染效力，为临床转化提供体内数据支撑。

优化嗜黏蛋白阿克曼菌的高密度培养与代谢物定向合成工艺，提升CFS中活性物质的产量，开发CFS的规模化制备技术，探索其在生鲜食品保鲜、食品加工环境消毒、饲料添加剂等场景的实际应用方案。

从分子层面解析CFS对沙门氏菌毒力相关基因（如鞭毛合成、III型分泌系统、生物被膜合成相关基因）的转录调控作用，明确其抗毒力的分子靶点与深层调控机制。

评估CFS对单增李斯特菌、致病性大肠杆菌、阪崎肠杆菌等其他常见食源性致病菌的抗菌活性，拓展其抗菌谱与应用范围。

研究CFS与食品工业中常用抑菌剂（如植物精油、细菌素、食用有机酸）的协同抑菌效应，开发复合抑菌制剂，降低使用剂量、提升沙门氏菌防控效果，降低食品工业的应用成本。

7.测量的数据及研究意义（标注原文对应图表）

不同浓度嗜黏蛋白阿克曼菌CFS处理下，鼠伤寒沙门氏菌SL1344和14028菌株36h内的生长曲线OD600nm数据，来自Fig. 1。研究意义：明确了嗜黏蛋白阿克曼菌CFS对两株沙门氏菌的生长具有浓度依赖性的抑制作用，证实了CFS的体外抑菌活性，为后续所有抗毒力实验的开展奠定了核心基础，同时确定了实验用CFS的有效浓度范围。

不同浓度CFS处理后，沙门氏菌的运动半径与相对运动率定量数据，以及运动表型图片，来自Fig. 2。研究意义：证实了CFS可浓度依赖性地显著抑制沙门氏菌的鞭毛运动能力，而运动性是沙门氏菌实现肠道定植、穿透黏液层的关键毒力因子，该结果首次揭示了CFS抑制沙门氏菌毒力的核心表型，为后续抗黏附、抗侵袭实验提供了机制支撑。

不同浓度CFS处理后，沙门氏菌的细胞表面疏水性活性百分比、自聚集活性百分比定量数据，来自Fig. 3。研究意义：明确了CFS可剂量依赖性降低沙门氏菌的细胞表面疏水性与自聚集能力，而这两个特性是沙门氏菌实现宿主细胞黏附、生物被膜形成与成熟的重要基础，该结果从细菌表面特性层面，解释了CFS抑制生物被膜与细胞黏附的内在原因。

不同培养时间、不同浓度CFS处理下，沙门氏菌生物被膜的结晶紫染色OD570nm定量数据，生物被膜的扫描电镜（SEM）微观形貌观察结果，以及生物被膜内细菌的活/死菌荧光染色结果，来自Fig. 4。研究意义：从定量、微观结构、细菌活性三个维度，全面证实了CFS对沙门氏菌生物被膜形成的强效抑制作用，明确了CFS可破坏生物被膜的致密三维结构、显著降低被膜内活菌数量；而生物被膜是沙门氏菌在食品加工环境中抵抗消毒、长期存活的关键形式，该结果为CFS在食品工业中防控沙门氏菌生物污染提供了核心实验依据。

CFS处理后，沙门氏菌对Caco-2细胞的黏附、侵袭菌落计数数据，pH中和后CFS对黏附、侵袭的影响数据，以及CFS处理后沙门氏菌在巨噬细胞RAW264.7内1h和24h的胞内存活菌落计数数据，来自Fig. 5。研究意义：在宿主细胞层面证实了CFS可显著降低沙门氏菌对肠道上皮细胞的黏附、侵袭能力，同时抑制其在巨噬细胞内的存活与增殖，而黏附、侵袭与胞内存活是沙门氏菌引发宿主肠道感染、实现全身播散的核心致病过程，该结果直接验证了CFS对沙门氏菌体内致病潜力的抑制作用；同时pH中和实验证实，其抗黏附侵袭效应并非仅依赖酸性环境，揭示了CFS多维度的抗毒力机制。

不同温度、pH中和、强酸强碱、多种蛋白酶处理后，CFS对沙门氏菌的抑菌活性OD600nm数据，来自Fig. 6。研究意义：明确了CFS的抑菌活性具有耐高温（37~121℃处理30min活性无显著变化）、对胃蛋白酶、胰蛋白酶等多种蛋白酶不敏感的特性，而在pH中和后抑菌活性几乎完全丧失，证实了CFS的核心抑菌活性成分是酸性物质，而非蛋白质、多肽类物质，为后续活性成分的鉴定、CFS的加工工艺与应用场景设计提供了关键的理化特性依据。

GC-MS检测的CFS中乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸的浓度定量数据，以及外添乙酸、丙酸（含pH调整组）对沙门氏菌生长的抑制作用OD600nm数据，来自Fig. 7。研究意义：定量明确了CFS中高丰度的短链脂肪酸为乙酸和丙酸，浓度分别达到104.72μg/mL和218.56μg/mL，同时证实了这两种短链脂肪酸是CFS发挥抑菌活性的核心效应物质之一，直接解析了CFS抑菌作用的关键物质基础。

UHPLC-MS/MS非靶向代谢组学分析的正负离子模式下的PLS-DA得分图、Top50差异代谢物热图、代谢物HMDB超类分类结果、差异代谢通路富集分析结果，来自Fig. 8。研究意义：全面鉴定了CFS中的代谢物组成，明确了有机酸及衍生物、脂质及类脂分子、有机杂环化合物是CFS中的三大核心代谢物类别，筛选出了CFS与空白培养基的显著差异代谢物，富集到C5支链二元酸代谢、乙醛酸和二羧酸代谢、三羧酸循环等关键差异代谢通路，为后续新型活性代谢物的挖掘、抑菌抗毒力机制的深入研究提供了全维度的代谢组学数据支撑。

不同培养时间CFS中的总蛋白与多糖浓度数据，来自Fig. S1。研究意义：证实了CFS中蛋白浓度无显著变化，而培养基中的多糖含量随嗜黏蛋白阿克曼菌的生长显著下降，排除了培养基营养消耗、蛋白类物质是抑菌核心成分的可能性，进一步锁定了酸性代谢物是CFS抑菌活性的核心物质。

2.5%黏蛋白对沙门氏菌生长的影响菌落计数数据，来自Fig. S2。研究意义：证实了嗜黏蛋白阿克曼菌培养基中的黏蛋白本身不会影响沙门氏菌的生长，排除了黏蛋白对实验结果的干扰，确保了CFS抑菌效应实验结果的可靠性与特异性。

UHPLC-MS/MS检测的正负离子模式下的代谢物鉴定数量统计数据，来自Table S1。研究意义：明确了代谢组学分析的检测覆盖度，正、负离子模式下分别鉴定到484个和435个代谢物，为差异代谢物的筛选、功能注释与通路分析提供了基础数据支撑。

8.核心结论

嗜黏蛋白阿克曼菌的无细胞上清液可浓度依赖性地抑制鼠伤寒沙门氏菌的生长，同时显著降低沙门氏菌的运动能力、细胞表面疏水性与自聚集能力，从源头抑制其毒力表型。

嗜黏蛋白阿克曼菌CFS可强效抑制沙门氏菌的生物被膜形成，破坏生物被膜的致密结构，降低被膜内活菌数量，具备防控食品加工环境中沙门氏菌生物膜污染的潜力。

嗜黏蛋白阿克曼菌CFS可显著降低沙门氏菌对人肠道上皮细胞的黏附与侵袭能力，同时抑制其在巨噬细胞内的胞内存活与增殖，可有效减弱沙门氏菌的宿主感染能力，且该抗黏附侵袭效应并非仅依赖酸性环境。

嗜黏蛋白阿克曼菌CFS的抑菌活性具有耐高温、对多种蛋白酶不敏感的特性，pH中和后活性基本丧失，其核心抑菌活性成分为酸性代谢产物，其中乙酸和丙酸是主要的短链脂肪酸类效应物质。

代谢组学分析显示，CFS中除短链脂肪酸外，还含有大量有机酸、脂质类等代谢产物，存在其他潜在的抗毒力活性物质，其作用是多成分协同的结果。

综上，嗜黏蛋白阿克曼菌的无细胞上清液对沙门氏菌具有良好的抗生物被膜与抗毒力特性，具备开发为食品用抗菌剂或食品添加剂的潜力，可用于食品工业中沙门氏菌污染的防控，以及沙门氏菌相关食源性感染的预防。

9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义

本研究使用芬兰Labsystems公司的Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析系统，测定了0%、25%、50%、75%、100%浓度梯度的CFS处理下，鼠伤寒沙门氏菌SL1344和14028两株菌36h内的生长动态，实验设置37℃恒温培养，每1小时自动读取OD600nm数值，每个组别设置3个生物学重复，其产生的实验数据具有以下核心研究意义：

第一，实现了沙门氏菌生长动态的全周期、高分辨率监测，精准量化了CFS的抑菌活性与浓度效应。传统的手动分光光度计法仅能获取离散时间点的OD值，无法完整捕捉细菌从延滞期、指数生长期到稳定期的全生长周期变化，易遗漏关键的生长动力学信息；而Bioscreen C仪器每1小时一次的全自动连续原位检测，完整描绘了不同浓度CFS处理下两株沙门氏菌36h内的连续生长曲线，精准发现CFS对沙门氏菌并非快速杀菌作用，而是浓度依赖性的生长延迟与增殖抑制效应——36h时100% CFS处理组的SL1344和14028菌株OD600值分别仅为空白对照组的64.8%和66.2%，明确了CFS的抑菌效价与剂量的正相关关系，为后续运动性、生物被膜、细胞实验等所有抗毒力实验的CFS浓度选择提供了直接的量化依据，避免了传统方法的检测误差与关键生长阶段信息的遗漏。

第二，高通量、多平行的同步培养与检测，保障了实验数据的可靠性与统计学效力。Bioscreen C仪器支持100孔板的同步恒温培养与原位吸光度检测，本研究中通过该仪器同时完成了5个CFS浓度梯度、2株沙门氏菌、3个生物学重复的生长曲线同步测定，完全消除了传统摇瓶分批培养中，温度、振荡幅度、培养时间、取样操作等环境因素的批次间波动带来的系统误差，确保了不同浓度组、不同菌株间生长表型对比的公平性与准确性。3个生物学重复的平行测定也为数据的统计学分析提供了充足的样本量，保障了“CFS可显著抑制沙门氏菌生长”这一核心基础结论的科学性、严谨性与可重复性。

第三，标准化的检测体系，为研究结果的学术可比性与后续验证提供了通用基准。Bioscreen C是微生物生长表型测定的国际通用商用设备，在微生物抑菌活性、生长动力学研究领域被广泛认可与使用。本研究采用该仪器获得的生长曲线数据，采用了标准化的培养温度、检测波长、读数频率与实验体系，可在不同实验室间进行重复、对比与验证，大幅提升了研究数据的学术价值，也为后续其他益生菌/下一代益生菌的无细胞上清液抑菌活性研究，提供了标准化的实验方法参考。

第四，厘清了CFS“抑菌”与“抗毒力”的效应边界，为后续抗毒力实验的开展提供了关键的前提与逻辑支撑。通过Bioscreen C的全周期生长曲线数据，明确了CFS对沙门氏菌的作用是生长增殖抑制，而非快速的杀菌作用，同时确定了不同浓度CFS的亚抑菌浓度与全剂量的作用差异。这一结果为后续运动性、生物被膜、细胞黏附侵袭等抗毒力实验的CFS浓度选择提供了关键依据，确保了后续实验中观察到的沙门氏菌毒力表型下降，是CFS的特异性抗毒力效应直接导致，而非细菌生长被完全抑制的间接结果，从实验设计层面保障了抗毒力机制研究的逻辑严谨性，避免了实验结果的假阳性解读。

第五，为嗜黏蛋白阿克曼菌CFS的产业化应用提供了基础的动力学数据支撑。Bioscreen C获得的全周期生长动力学数据，明确了CFS对沙门氏菌的抑制时效、最低有效浓度与剂量效应关系，可直接指导食品工业中CFS的应用设计：比如在生鲜肉、水产品等易被沙门氏菌污染的食品保鲜中，可根据该生长动力学数据确定CFS的最低有效添加量；在食品加工设备、生产环境的消毒中，可明确CFS的最短作用时间与使用浓度，为其从实验室基础研究走向食品工业的实际应用，提供了核心的基础动力学数据。