全自动生长曲线分析仪

Engineering carboxylic acid reductase for selective synthesis of medium-chain fatty alcohols in yeast

羧酸还原酶的工程化改造实现酵母中中链脂肪醇的选择性合成

来源：PNAS | September 15, 2020 | vol. 117 | no. 37 |22974–22983

1. 论文摘要

中链脂肪醇（MCFOHs，碳链长度 C6~C12）是柴油、航空煤油等化石燃料的潜在替代品，在各类工业生产中具有广泛应用。目前中链脂肪醇主要来源于石油化工或植物油提取，而微生物生物合成是一种可规模化、高稳定性且可持续的替代方案。本研究旨在构建可选择性生产中链脂肪醇的酿酒酵母平台，核心策略是对来源于海分枝杆菌的羧酸还原酶（MmCAR）进行性能定制化改造。研究综合采用了定向进化、结构引导的半理性设计、理性设计等多种蛋白工程策略，并基于酶底物中链脂肪酸（MCFAs）的细胞解毒效应，开发了一套生长偶联的高通量筛选体系，成功鉴定出催化活性提升的 MmCAR 变体。详细表征结果显示，MmCAR 的底物特异性与催化活性均得到成功优化，携带最优变体的酵母菌株中链脂肪醇产量较表达野生型酶的菌株提升 2.8 倍。通过敲除酵母内源中链脂肪酸外排基因 TPO1，中链脂肪醇的合成得到进一步提升，最终工程菌株滴度达到 252 mg/L，实现了酿酒酵母在基本培养基中中链脂肪醇合成的重大突破。

2. 论文关键词

羧酸还原酶、蛋白工程、高通量筛选、中链脂肪醇、酿酒酵母

3. 研究目的

构建可高效、选择性从头合成中链脂肪醇（C6~C12）的酿酒酵母细胞工厂，解决传统石化来源的环境问题与植物油来源的粮食竞争问题；

突破野生型 MmCAR 底物谱宽泛、对中链脂肪酸催化特异性与活性不足的核心瓶颈，通过多维度蛋白工程策略，实现 MmCAR 对中链脂肪酸的催化活性与底物选择性的双重定向提升；

开发适配 MmCAR 大库容突变体文库的高效高通量筛选方法，解决多功能域大酶定向进化中筛选效率低、成本高的行业难题；

结合代谢工程策略强化胞内中链脂肪酸前体供应，与蛋白工程改造形成协同效应，进一步提升酿酒酵母中中链脂肪醇的从头合成效率。

4. 研究思路

筛选体系的理论验证与建立：首先对比验证中链脂肪酸与其对应脂肪醇的酵母细胞毒性差异，明确 MmCAR 催化中链脂肪酸还原为脂肪醇的过程可实现底物解毒，以此为核心设计生长偶联的高通量筛选工作流；同时筛选确定适配 MmCAR 的磷酸泛酰巯基乙胺转移酶 NpgA，保障 MmCAR 在酿酒酵母中的功能激活与活性表达。

多维度的 MmCAR 蛋白工程改造：针对 MmCAR 的腺苷化 A 结构域、PCP 结构域、还原酶 R 结构域的功能特性，采用三种互补的工程化策略：① 对全长 MmCAR 进行定向进化，通过易错 PCR 构建随机突变文库，结合梯度升高的 C8 脂肪酸选择压力，富集并筛选获得催化活性提升的变体；② 对负责底物识别的 A 结构域开展理性设计与定向进化，基于同源蛋白结构比对，通过定点突变引入大位阻氨基酸缩小底物结合口袋，同时构建 A 结构域随机突变文库筛选优势变体，定向提升酶对中链底物的特异性与活性；③ 对负责催化还原的 R 结构域开展定点饱和突变与结构域工程，针对调控 R 结构域活性开关的关键位点 983~985 构建饱和突变文库，同时尝试异源 PCP-R 双结构域的共表达与融合表达，进一步提升酶的催化效率。

优势突变的组合与性能系统表征：将上述筛选获得的有益突变进行组合，获得催化活性与底物特异性协同提升的最优变体 RF1+303；通过体内产物谱分析、体外酶活测定、酶促反应动力学表征，全面验证变体的底物偏好性转变与催化效率提升的分子机制。

宿主代谢工程协同优化：针对胞内中链脂肪酸前体供应不足的问题，敲除酵母质膜上的中链脂肪酸外排转运蛋白编码基因 TPO1，减少胞内前体的分泌流失，扩增胞内中链脂肪酸池，进一步强化中链脂肪醇的合成通量。

最终工程菌株的性能评估：对整合了最优 MmCAR 变体与 TPO1 敲除的最终菌株进行发酵性能测试，测定中链脂肪醇的最终合成滴度，验证整套改造策略的有效性与协同性。

5. 研究亮点

首创生长偶联的高通量筛选体系：首次利用中链脂肪酸的细胞毒性与 MmCAR 的催化解毒效应，建立了基于细胞生长的 MmCAR 突变体高通量筛选方法，无需复杂的产物检测即可实现大库容文库的高效富集与筛选，为 CAR 家族多功能域酶的工程化改造提供了全新的筛选范式。

多策略协同实现酶性能的双重提升：针对 MmCAR 的多结构域特性，同步采用定向进化、结构引导的半理性设计、理性设计策略，分别对底物识别与催化还原的核心结构域进行精准改造，同时实现了酶对中链脂肪酸的催化活性与底物选择性的显著提升，突破了野生型 CAR 底物谱宽泛的核心瓶颈。

发现 CAR 酶改造的全新关键靶点：明确了 A 结构域中 Q302、I303 位点是调控底物链长特异性的核心位点，引入色氨酸突变可通过空间位阻缩小底物结合口袋，显著提升对中链脂肪酸的偏好性；同时发现 R 结构域的 983~985 位点是调控 CAR 催化活性的关键开关区域，为 CAR 家族酶的理性设计提供了全新的结构靶点与理论依据。

蛋白工程与代谢工程的协同优化：将核心酶的蛋白工程改造与宿主代谢通路优化深度结合，通过敲除 TPO1 减少前体流失，与优化后的 MmCAR 变体形成协同效应，最终在无外源前体添加的基本培养基中实现 252 mg/L 的中链脂肪醇从头合成，较原始菌株提升 3.2 倍，是当时酿酒酵母基本培养基中中链脂肪醇合成的重要突破。

完整的体内外性能验证体系：结合体内产物组分分析、体外酶活测定、酶促反应动力学表征，系统验证了改造后 MmCAR 变体的底物偏好性转变，明确了催化效率提升的分子机制，为其他大型多功能域酶的工程化改造提供了完整、可复用的研究范式。

6. 可延伸的研究方向

改造后 MmCAR 变体的结构生物学解析：解析最优 MmCAR 变体的晶体结构，明确关键突变调控底物特异性与催化活性的分子机制，为 CAR 酶的进一步精准理性设计、定制化底物谱改造提供高分辨率结构基础。

酿酒酵母宿主的产物耐受性工程：针对中链脂肪酸与中链脂肪醇对酵母细胞的毒性，通过适应性实验室进化、转录因子工程、细胞膜工程等策略，提升宿主对底物与产物的耐受性，解除产物毒性对发酵滴度的核心限制。

发酵工艺的优化与工业化放大：通过分批补料发酵、生长与产物合成解耦、双相发酵萃取等工艺优化，进一步提升中链脂肪醇的发酵滴度、碳得率与生产强度；同时开展中试放大研究，推动该技术的工业化应用。

CAR 酶的功能拓展与定制化改造：基于本研究建立的改造与筛选策略，对 CAR 酶进行定制化设计，实现对特定链长脂肪酸、支链脂肪酸、芳香族羧酸的高效还原，拓展 CAR 酶在精细化学品、医药中间体、生物燃料合成中的应用场景。

合成途径的全局代谢优化：对酿酒酵母的乙酰 - CoA 前体代谢、脂肪酸合成途径、NADPH 辅因子再生体系进行全局系统改造，进一步提升碳通量向中链脂肪醇合成的分配，突破代谢瓶颈，实现产物滴度的跨越式提升。

无细胞生物催化体系的构建：基于改造后的高效 MmCAR 变体，构建中链脂肪醇合成的无细胞催化体系，解决全细胞发酵中的底物 / 产物毒性、跨膜转运、副反应竞争等问题，实现产物的高效、高纯度体外合成。

7. 测量数据、对应图表及研究意义

C8 脂肪酸与对应 C8 脂肪醇的酵母细胞毒性对比数据；表达 / 不表达野生型 MmCAR 的酵母菌株在不同浓度 C8 脂肪酸中的生长数据。

数据来源：Fig. 2 Design of the growth-coupled screening approach.（B、C、D 子图）

研究意义：证实了 C8 脂肪酸的细胞毒性显著高于对应脂肪醇，而 MmCAR 的表达可通过将 C8 脂肪酸转化为低毒的脂肪醇实现细胞解毒，为生长偶联的高通量筛选体系建立提供了核心理论依据；同时精准确定了 300 mg/L C8 脂肪酸为文库筛选的最佳选择压力，保障了筛选的有效性与严谨性。

全长 MmCAR 定向进化获得的突变体（M150、M7、M9、M11）在酿酒酵母中合成中链脂肪醇的总滴度与各链长组分数据。

数据来源：Fig. 3 The synthesis of MCFOHs in S. cerevisiae by expressing variants derived from directed evolution of full-length MmCAR.

研究意义：验证了基于生长的高通量筛选体系可有效富集并获得对中链脂肪酸催化活性提升的 MmCAR 变体，其中 M150 变体使中链脂肪醇产量提升超 50%，为后续的迭代进化与组合突变提供了优质模板。

A 结构域理性设计突变体（AD302、AD303）、定向进化突变体（AD69、AD10）的中链脂肪醇合成产量数据。

数据来源：Fig. 4 The synthesis of MCFOHs in S. cerevisiae by MmCAR variants generated through A domain modifications.（C、D 子图）

研究意义：证实了通过理性设计在 A 结构域底物结合口袋引入大位阻色氨酸残基，可有效缩小催化口袋，显著提升 MmCAR 对中链脂肪酸的底物偏好性与催化活性，其中 AD303（I303W）变体使中链脂肪醇产量提升 61%，为 CAR 酶底物特异性改造提供了直接、高效的策略。

R 结构域 983~985 位点饱和突变筛选获得的变体（RE5、RE6、RB6、RF1）在 C8 脂肪酸胁迫下的生长曲线数据；各变体的中链脂肪醇合成产量数据；异源 PCP-R 双结构域共表达 / 融合变体的中链脂肪醇产量数据。

数据来源：Fig. 5 The synthesis of MCFOHs in S. cerevisiae by MmCAR variants generated through R domain modifications.（C、D、F 子图）

研究意义：明确了 R 结构域的 983~985 位点是调控 MmCAR 催化活性的关键开关区域，其中 RF1 变体使中链脂肪醇产量提升 2.4 倍，是单一组分改造中活性提升最显著的变体；同时证实了异源 PCP-R 双结构域的融合表达可有效提升中链脂肪醇合成效率，为 CAR 酶的结构域工程提供了全新思路。

不同有益突变组合的 MmCAR 变体的中链脂肪醇合成产量与组分数据。

数据来源：Fig. 6 The production of MCFOHs in strains with combined modification in MmCAR.

研究意义：验证了 A 结构域与 R 结构域的有益突变可实现协同效应，其中最优组合变体 RF1+303 使中链脂肪醇产量达 229 mg/L，较野生型提升 2.8 倍，实现了催化活性与底物特异性的同步优化。

野生型 MmCAR 与关键变体（AD303、M150、RF1）表达菌株的胞内脂肪醇气相色谱谱图、不同链长脂肪醇的占比数据；各变体粗酶对不同链长脂肪酸的 NADPH 氧化速率（体外酶活）数据。

数据来源：Fig. 7 Characterization of the substrate specificity of mutated MmCARs.（A、B、C 子图）

研究意义：在体内与体外层面双重证实，改造后的 MmCAR 变体对 C6~C10 中链脂肪酸的催化活性显著提升，对 C12 以上长链脂肪酸的活性无显著提升甚至降低，中链脂肪醇在总产物中的占比从野生型的 59% 最高提升至 78%，直接验证了改造策略成功实现了 MmCAR 底物特异性的定向转变。

TPO1 敲除菌株（YH28）与亲本菌株的胞外中链脂肪酸产量、最终 OD600 数据；TPO1 敲除菌株表达最优 MmCAR 变体后的中链脂肪醇最终产量与生长数据。

数据来源：Fig. 8 The effect of TPO1 deletion on MCFOH production in S. cerevisiae.（B、C 子图）

研究意义：证实了敲除 TPO1 可有效减少中链脂肪酸的胞外分泌，扩增胞内前体池，使中链脂肪醇最终产量进一步提升 11% 至 252 mg/L，较原始菌株提升 3.2 倍，完成了蛋白工程与代谢工程的协同优化，实现了酿酒酵母在基本培养基中中链脂肪醇从头合成的重大突破。

不同来源磷酸泛酰巯基乙胺转移酶（PPTases）与 MmCAR 共表达菌株的中链脂肪醇产量数据。

数据来源：SI Appendix, Fig. S3

研究意义：筛选确定了来自构巢曲霉的 NpgA 是适配 MmCAR 的最优 PPTase，为后续 MmCAR 在酿酒酵母中的功能激活与活性测定奠定了基础。

定向进化筛选过程中，不同 MmCAR 变体在 C8 脂肪酸胁迫下的生长表型数据。

数据来源：SI Appendix, Fig. S4、Fig. S5

研究意义：验证了筛选获得的变体在 C8 脂肪酸胁迫下具有显著更优的生长性能，与中链脂肪醇产量提升的表型高度一致，进一步证实了生长偶联筛选体系的可靠性。

AD303 变体与野生型 MmCAR 的酶促反应动力学参数（kcat、Km）数据。

数据来源：SI Appendix, Fig. S12

研究意义：从酶动力学层面证实了 I303W 突变使 MmCAR 对底物的催化周转效率（kcat）提升 2 倍，明确了变体催化活性提升的核心分子机制。

外源添加不同浓度 C8 脂肪酸对菌株生长与中链脂肪醇产量的影响数据；双相发酵对中链脂肪醇产量的影响数据。

数据来源：SI Appendix, Fig. S14、Fig. S15

研究意义：证实了外源添加 C8 脂肪酸会因细胞毒性抑制菌株生长与产物合成，双相发酵会导致中链脂肪酸前体被有机相捕获而降低产量，为选择敲除 TPO1 扩增胞内前体池的策略提供了直接实验依据。

8. 核心研究结论

成功建立了基于中链脂肪酸解毒效应的生长偶联高通量筛选体系，可高效从 10^7 级别的大库容突变体文库中筛选获得对中链脂肪酸催化活性提升的 MmCAR 变体，为 CAR 家族多功能域酶的工程化改造提供了全新的高效筛选方法。

通过多策略蛋白工程改造，成功实现了 MmCAR 对中链脂肪酸催化活性与底物特异性的双重提升：理性设计获得的 AD303（I303W）变体显著提升了对中链底物的偏好性，R 结构域饱和突变获得的 RF1 变体大幅提升了催化效率，二者组合的最优变体 RF1+303 使中链脂肪醇产量较野生型提升 2.8 倍。

明确了 MmCAR 的 A 结构域底物结合口袋的空间位阻是调控底物链长特异性的核心因素，R 结构域的 983~985 位点是调控酶催化活性的关键开关区域，为 CAR 家族酶的理性设计与精准改造提供了全新的靶点与理论依据。

敲除酿酒酵母内源中链脂肪酸外排基因 TPO1，可有效减少胞内中链脂肪酸的分泌，扩增胞内前体池，使中链脂肪醇产量进一步提升 11%，最终工程菌株在基本培养基中实现了 252 mg/L 的中链脂肪醇从头合成，较原始菌株提升 3.2 倍，是当时酿酒酵母在基本培养基中中链脂肪醇合成的重要突破。

体内产物谱与体外酶活测定双重证实，改造后的 MmCAR 变体对 C6~C10 中链脂肪酸的催化活性显著提升，对长链脂肪酸的活性无显著提升甚至降低，中链脂肪醇在总脂肪醇产物中的占比从野生型的 59% 最高提升至 78%，成功实现了中链脂肪醇的选择性合成。

蛋白工程与代谢工程的协同优化，是实现酿酒酵母中中链脂肪醇高效选择性合成的有效策略，本研究建立的改造与筛选范式，可为其他脂肪酸衍生物类生物燃料与精细化学品的微生物合成提供重要的技术参考。

9. 芬兰 Bioscreen 仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义

本研究中使用芬兰 Bioscreen C MBR 全自动生长曲线分析仪，对高通量筛选获得的 MmCAR 突变体菌株，在中链脂肪酸（C8 FA）胁迫下的动态生长过程进行了自动化、高通量、高重复性的实时监测，获得了不同菌株的精准生长曲线数据，是整个研究筛选体系落地的核心技术支撑，其具体研究意义分为以下 5 个核心层面：

实现大库容突变体文库的高通量筛选与验证

本研究中全长 MmCAR 定向进化的突变体文库库容达 6×10^7，初筛后仍有数百个候选克隆需要验证。Bioscreen 仪器支持 96 孔板的同步恒温培养与 OD600 实时监测，可在无人工干预的条件下，同步完成数十至上百个菌株在 C8 脂肪酸胁迫下的生长曲线测定，大幅提升了筛选效率，解决了传统手动分光光度计测定法通量低、操作繁琐、人为误差大的痛点。通过生长曲线数据，可快速量化不同 MmCAR 变体的解毒能力，精准筛选出生长速率更快、最终生物量更高的优势变体，为后续的中链脂肪醇产量验证缩小了范围，保障了大库容文库筛选的可行性与高效性。

建立生长表型与酶催化活性的强关联，实现酶活的快速半定量评估

本研究筛选体系的核心逻辑是 “MmCAR 对 C8 脂肪酸的催化活性越高，细胞解毒能力越强，在 C8 脂肪酸胁迫下的生长性能越优”。Bioscreen 仪器提供的高时间分辨率生长曲线数据，可精准量化菌株的延迟期、比生长速率、最大 OD600 等关键生长参数，实现对 MmCAR 变体催化活性的快速半定量评估。例如，第一轮筛选中，通过 Bioscreen 监测确定 M150 变体在 330 mg/L C8 脂肪酸中生长速率最快，后续验证其中链脂肪醇产量较野生型提升超 50%，直接证实了生长曲线数据与酶活、产物合成能力的强正相关性。这种基于生长曲线的活性评估，无需复杂的产物提取与色谱检测，可快速完成大量候选克隆的初筛与排序，大幅降低了筛选的成本与周期。

精准确定筛选的最佳选择压力，保障筛选体系的严谨性

筛选体系的选择压力（C8 脂肪酸浓度）直接决定了筛选的有效性：浓度过低无法区分酶活差异，浓度过高则会导致所有菌株无法生长，出现假阴性结果。Bioscreen 仪器通过连续监测不同 C8 脂肪酸浓度下，表达野生型 MmCAR 菌株的动态生长过程，精准确定了 290~330 mg/L 为文库初筛的最佳浓度范围，370~380 mg/L 为高活性变体复筛的严苛压力。这一浓度的精准确定，是整个筛选体系成功的核心前提，既保证了对低活性野生型酶的筛选压力，又能让高活性变体正常生长，有效避免了假阳性与假阴性结果，保障了筛选结果的可靠性。

排除非特异性生长干扰，验证突变体表型的真实性

在突变体筛选过程中，可能出现菌株因自身脂肪酸耐受性基因组突变（而非 MmCAR 活性提升）而在 C8 脂肪酸中生长的假阳性克隆。Bioscreen 仪器提供的完整生长曲线数据，可结合质粒回补、重复传代实验，验证菌株的生长优势是否完全依赖于 MmCAR 质粒的表达。同时，通过多生物学重复的生长曲线测定，可排除菌株生长的随机误差，验证优势变体生长表型的重复性与稳定性，确保筛选获得的生长优势确实来源于 MmCAR 的催化活性提升，而非宿主基因组的自发突变，保障了实验结论的严谨性。

为后续酶学表征与菌株工程化提供关键预实验依据

Bioscreen 获得的生长曲线数据，可初步预判 MmCAR 变体的底物偏好性与催化效率。例如，在不同链长中链脂肪酸（C6、C8、C10）胁迫下的生长曲线测定，可快速评估变体对不同底物的催化活性，为后续的体外酶活测定、底物特异性表征缩小了研究范围。同时，菌株在产物合成条件下的生长特性数据，也为后续的发酵工艺优化、培养基配方调整提供了关键的基础数据，支撑了最终工程菌株的发酵性能优化。