Identification of an anti-virulence drug that reverses antibiotic resistance in multidrug resistant bacteria
一种可逆转多重耐药菌抗生素耐药性的抗毒力药物的鉴定
来源：Biomedicine & Pharmacotherapy 153 (2022) 113334
1. 论文摘要
多重耐药（MDR）菌的持续高流行严重威胁全球公共健康，针对多重耐药菌相关感染，亟需开发新型抗菌药物与治疗策略。筛选可逆转抗生素耐药性的潜在化合物，是缓解这一危机的有效策略。本研究通过高通量筛选方法，发现羟氯扎胺（oxyclozanide）可通过促进四环素在耐药菌胞内的积累，增强四环素类抗生素对多重耐药致病菌的抗菌活性。机制研究表明，羟氯扎胺可通过破坏细菌细胞膜、诱导细菌活性氧（ROS）过量产生，直接发挥杀菌作用；同时可有效降低金黄色葡萄球菌毒力蛋白的分泌，中和已产生的 α- 溶血素，从而显著缓解细菌引发的炎症反应。最终，动物感染实验证实羟氯扎胺可在体内显著逆转细菌的四环素耐药性。综上，本研究结果证实羟氯扎胺是一种兼具新型抗生素佐剂、直接抗菌、抗毒力三重功能的多功能化合物，可应对多重耐药菌感染，提升全球范围内多重耐药菌所致持续性感染的治疗效果。
2. 论文关键词
抗毒力、抗菌、羟氯扎胺、佐剂、多重耐药菌
3. 研究目的
针对全球多重耐药菌（尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌 MRSA）流行、四环素类抗生素广泛耐药的公共健康危机，通过高通量筛选 FDA 批准的上市药物库，寻找可高效逆转四环素耐药性的新型抗生素佐剂；
系统验证候选化合物羟氯扎胺的体外直接抗菌活性、与四环素的协同抗菌谱，评估其耐药诱导风险与生物安全性；
深入解析羟氯扎胺直接杀菌、协同四环素逆转耐药性的分子机制，明确其作用靶点与核心调控通路；
验证羟氯扎胺对金黄色葡萄球菌关键毒力因子的抑制与中和作用，以及抗生物膜活性，明确其抗毒力功能与机制；
在多种动物感染模型中验证羟氯扎胺与四环素联用的体内治疗效果，为临床多重耐药菌感染提供安全、有效的老药新用方案。
4. 研究思路
高通量筛选锁定候选化合物：以多重耐药金黄色葡萄球菌 S1 为筛选菌株，对 1287 种 FDA 批准的化合物进行高通量筛选，评估其与四环素联用的协同抗菌活性，最终锁定水杨酰苯胺类抗寄生虫药羟氯扎胺为核心候选物。
体外协同效应与安全性系统验证：通过微量肉汤稀释法测定羟氯扎胺与四环素对多种耐药菌的最小抑菌浓度（MIC），棋盘法计算分级抑菌浓度指数（FICI），验证其对 90 株临床耐药菌的广谱协同效应；通过连续传代实验评估耐药诱导风险，通过溶血实验、细胞毒性实验验证联用方案的体外安全性。
直接杀菌机制解析：通过时间 - 杀菌曲线、Laurdan 荧光探针、SYTOX Green 染色、扫描电镜（SEM）、ROS 检测及 ROS 清除剂回补实验，明确羟氯扎胺通过破坏细菌细胞膜、诱导 ROS 过量积累发挥直接杀菌作用的核心机制。
逆转四环素耐药的分子机制解析：通过 LC-MS/MS 直接检测细菌胞内四环素积累量，结合膜电位、质子动力势、胞内 ATP 水平、外排泵功能检测、耐药基因转录水平分析及全转录组测序，阐明羟氯扎胺通过破坏细菌能量代谢、抑制外排泵功能，促进四环素胞内积累，从而逆转耐药的核心机制。
抗毒力与抗生物膜活性验证：通过 ELISA 检测羟氯扎胺对金黄色葡萄球菌 PVL、α- 溶血素分泌的抑制作用，通过溶血实验、微量热泳动（MST）、局域表面等离子体共振（LSPR）、等温滴定量热法（ITC）验证其对 α- 溶血素的直接结合与活性中和作用；通过结晶紫染色、活菌计数实验评估其对生物膜的抑制与清除活性。
体内药效验证：通过大蜡螟幼虫感染模型、小鼠腹膜炎模型、小鼠皮肤脓肿模型，评估羟氯扎胺与四环素联用对感染动物存活率、组织细菌载量、炎症反应与病理损伤的影响，验证其体内逆转耐药、治疗多重耐药菌感染的有效性。
5. 研究亮点
老药新用的重大发现：首次发现 FDA 批准的抗寄生虫药羟氯扎胺可作为新型四环素佐剂，高效逆转多重耐药菌的四环素耐药性，最高可使四环素的 MIC 降低 128 倍，对 90 株临床人源和动物源耐药菌株均具有良好协同效应，为应对抗生素耐药危机提供了快速可转化的老药新用方案。
三重抗菌功能的独特优势：羟氯扎胺兼具直接杀菌、抗生素佐剂、抗毒力三大核心功能，不仅能直接杀伤多重耐药菌、恢复四环素的抗菌活性，还能抑制并中和金黄色葡萄球菌关键毒力因子，缓解感染引发的炎症与组织损伤，多维度对抗耐药菌感染，区别于单一功能的抗生素佐剂。
全新的耐药逆转分子机制：揭示了羟氯扎胺逆转四环素耐药的双重核心机制 —— 通过破坏细菌细胞膜电位与质子动力势，抑制细菌能量代谢，降低胞内 ATP 水平，进而抑制 ATP 驱动的四环素外排泵活性；同时下调四环素耐药基因 tet (K) 的转录，最终显著促进四环素在细菌胞内的积累，为四环素类抗生素佐剂的开发提供了全新的作用靶点与机制参考。
极低的耐药诱导风险：羟氯扎胺靶向细菌细胞膜发挥作用，连续传代 30 天仅使细菌对其 MIC 提升 2 倍，与四环素联用也未诱导高耐药性；而单独使用四环素会快速诱导细菌产生 64 倍 MIC 提升的高耐药性，从根源上解决了抗生素治疗中耐药快速产生的核心痛点。
优异的体内外有效性与安全性：在多种体内外感染模型中均证实羟氯扎胺与四环素联用的强效抗菌效果，同时二者联用不会增加溶血毒性与真核细胞毒性，在有效浓度范围内具有良好的生物安全性，为临床转化奠定了坚实的基础。
优异的抗生物膜活性：羟氯扎胺单独或与四环素联用，均可有效抑制金黄色葡萄球菌生物膜形成，并清除成熟生物膜内的持留菌，为生物膜相关的慢性难治性感染（如糖尿病足、烧伤感染）提供了新的治疗候选物。
6. 可延伸的研究方向
抗菌谱与联用场景的拓展：探究羟氯扎胺与四环素类其他抗生素（米诺环素、替加环素）的协同效应，验证其对四环素灭活酶 Tet (X) 介导的高等级耐药的逆转效果；同时评估羟氯扎胺与 β- 内酰胺类、氨基糖苷类、糖肽类等其他类别抗生素的联用活性，拓展其临床应用场景。
药物结构优化与制剂开发：基于羟氯扎胺的作用机制，对其进行结构修饰，提升其抗菌活性、协同效应与体内药代动力学特性；开发脂质体、纳米粒等新型制剂，解决羟氯扎胺口服吸收差、系统循环水平低的问题，提升其体内生物利用度与病灶靶向性。
临床转化研究：开展羟氯扎胺与四环素联用治疗耐药菌感染的临床试验，重点针对皮肤软组织感染、腹腔感染等适应症，优化临床给药方案，评估其在人体中的安全性、耐受性与有效性，推动该方案的临床落地。
作用靶点的精准鉴定：通过化学蛋白质组学、冷冻电镜等技术，明确羟氯扎胺在细菌细胞膜上的直接作用靶点，解析其与 α- 溶血素结合的关键结构域与氨基酸位点，从原子层面阐明其分子作用机制，为后续药物优化提供结构基础。
联合治疗方案的升级：探究羟氯扎胺与抗菌肽、噬菌体、免疫调节剂、抗菌抗体等联用的抗耐药菌感染效果，开发 “杀菌 + 抗毒力 + 免疫调节” 的多维度联合治疗方案，应对复杂的临床多重耐药菌感染。
其他致病菌的活性验证：评估羟氯扎胺对结核分枝杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌等其他难治性革兰氏阴性耐药菌的抗菌与佐剂活性，拓展其抗菌谱与临床应用范围。
农业领域应用探索：针对畜禽养殖中的多重耐药菌感染问题，评估羟氯扎胺作为兽药抗菌增效剂的可行性，为畜禽源耐药菌防控提供新的解决方案。
7. 测量数据、对应图表及研究意义
羟氯扎胺与多种抗生素的协同抑菌能力数据；羟氯扎胺与四环素联用对不同耐药菌株的 FIC 指数、四环素 MIC 的增效倍数数据；90 株临床多重耐药菌的协同效应统计数据；细菌连续传代后的耐药性发展（MIC 变化倍数）数据。
数据来源：Fig. 1 Synergistic activity of oxyclozanide with tetracycline.（B、D、F 子图）、Table 1 Adjuvant potency of the synergistic scheme of oxyclozanide and tetracycline on multidrug-resistant and sensitive strains.、Supplementary Fig. 1
研究意义：证实了羟氯扎胺可特异性强效增强四环素对多重耐药菌的抗菌活性，增效倍数最高达 128 倍，对 90 株临床耐药菌具有广谱协同效应；明确了羟氯扎胺与四环素联用可显著延缓细菌耐药性产生，而单独使用四环素会快速诱导高耐药性，为羟氯扎胺作为四环素新型佐剂提供了核心的体外药效依据。
四环素单独、羟氯扎胺单独及二者联用处理下，金黄色葡萄球菌 S1 的 21 小时动态生长曲线数据。
数据来源：Fig. 1C
研究意义：直观证实了亚抑菌浓度的四环素或羟氯扎胺单独使用均无法抑制细菌生长，而二者联用可完全抑制金黄色葡萄球菌的增殖，直接验证了二者的协同抑菌效应，为后续机制研究奠定了核心表型基础。
羟氯扎胺、氯氰碘柳胺、氯硝柳胺对金黄色葡萄球菌 S1 的时间 - 杀菌曲线数据。
数据来源：Fig. 2A
研究意义：证实了 4×MIC 浓度的羟氯扎胺具有强效快速的杀菌活性，而同家族的氯氰碘柳胺、氯硝柳胺无明显杀菌效果，明确了羟氯扎胺在水杨酰苯胺类药物中独特的杀菌能力，为后续抗菌机制研究指明了方向。
羟氯扎胺处理后金黄色葡萄球菌的细胞膜流动性、细胞膜完整性（SYTOX Green 荧光强度）、胞内 ROS 水平数据；ROS 清除剂 NAC 对羟氯扎胺杀菌效果的回补实验数据。
数据来源：Fig. 2B、C、E、F
研究意义：揭示了羟氯扎胺的直接杀菌核心机制：其可显著降低细菌细胞膜流动性，破坏细胞膜完整性，同时诱导细菌胞内 ROS 过量积累；ROS 清除剂可显著缓解羟氯扎胺的杀菌效果，证实 ROS 过量积累是羟氯扎胺发挥杀菌作用的关键机制。
羟氯扎胺处理后金黄色葡萄球菌的扫描电镜（SEM）形态学观察数据。
数据来源：Fig. 2D
研究意义：从形态学层面直观证实了羟氯扎胺可造成金黄色葡萄球菌细胞严重损伤，出现表面不规则、凹陷、塌陷、裂解等表型，而同家族药物无此效应，直接验证了羟氯扎胺对细菌细胞膜的破坏作用。
羟氯扎胺对 J774A.1 巨噬细胞的细胞毒性数据；对金黄色葡萄球菌感染的 J774A.1 细胞的 LDH 释放影响数据；胞内金黄色葡萄球菌活菌计数数据；感染细胞的活死染色结果数据。
数据来源：Fig. 3A、B、C、D
研究意义：证实了羟氯扎胺在有效浓度范围内无明显真核细胞毒性；单独使用羟氯扎胺或四环素无法有效清除胞内金黄色葡萄球菌，而二者联用可使胞内细菌减少 99.9%，显著提升感染细胞存活率，降低细胞损伤，证实了该联合方案在治疗胞内菌感染中的巨大潜力。
LC-MS/MS 检测的羟氯扎胺处理后，金黄色葡萄球菌胞内四环素、卡那霉素的积累量数据。
数据来源：Fig. 4A、C
研究意义：直接证实了羟氯扎胺可剂量依赖性地促进四环素在细菌胞内的积累，而对氨基糖苷类抗生素卡那霉素无此效应，明确了羟氯扎胺逆转四环素耐药性的核心表型是提升胞内四环素浓度。
羟氯扎胺对细菌细胞膜电位、胞内 ROS 水平、质子动力势（PMF）、胞内 ATP 水平、氧气消耗速率的影响数据。
数据来源：Fig. 4B、D、E、F、G
研究意义：揭示了羟氯扎胺可破坏细菌细胞膜电位与质子动力势，剂量依赖性地降低胞内 ATP 水平，提升氧气消耗速率与 ROS 产生，明确了羟氯扎胺通过破坏细菌膜功能、抑制能量代谢，进而影响外排泵功能的核心作用机制。
羟氯扎胺对四环素耐药基因 tet (K) 的转录水平影响数据；对细菌 EtBr 外排的抑制作用数据。
数据来源：Fig. 4H、I
研究意义：证实了羟氯扎胺可剂量依赖性地下调 tet (K) 基因的转录，同时显著抑制细菌外排泵的功能，明确了其提升胞内四环素积累的两个核心途径：抑制外排泵编码基因的表达、直接抑制外排泵的转运活性。
四环素单独处理与四环素 - 羟氯扎胺联用处理后，金黄色葡萄球菌的全转录组测序数据，包括差异表达基因数量、GO 功能注释、KEGG 富集分析，以及核糖体、氧化磷酸化、ABC 转运体等关键通路的基因表达变化数据。
数据来源：Fig. 5
研究意义：从全转录组层面验证了羟氯扎胺与四环素联用的分子机制：联用显著上调细菌核糖体合成相关基因，下调氧化磷酸化、硝基还原酶、ABC 转运体（外排泵）相关基因的表达，进一步佐证了羟氯扎胺通过抑制细菌能量代谢、外排泵功能，提升胞内四环素浓度，进而增强四环素对细菌蛋白合成的抑制作用。
羟氯扎胺对金黄色葡萄球菌毒力因子 PVL、α- 溶血素（Hla）的分泌抑制数据；对 Hla 溶血活性的中和作用数据；羟氯扎胺与 Hla 的直接结合亲和力数据（MST、SPR、ITC）。
数据来源：Fig. 6A、B、C、D、E、Supplementary Fig. 3A
研究意义：证实了羟氯扎胺的双重抗毒力机制：不仅能显著抑制金黄色葡萄球菌 PVL 和 Hla 的分泌，还能直接与 Hla 蛋白高亲和力结合，中和其溶血活性，为其缓解细菌感染引发的炎症反应与宿主损伤提供了核心理论依据。
羟氯扎胺单独及与四环素联用，对金黄色葡萄球菌生物膜的抑制与杀菌活性数据。
数据来源：Fig. 6F、Supplementary Fig. 3B
研究意义：证实了羟氯扎胺单独或与四环素联用，均可有效抑制金黄色葡萄球菌生物膜的形成，并清除成熟生物膜内的活菌，为生物膜相关的慢性难治性感染治疗提供了新的候选方案。
大蜡螟幼虫感染模型、小鼠腹膜炎感染模型中，不同处理组的动物存活率数据；小鼠皮肤脓肿模型中的组织细菌载量数据。
数据来源：Fig. 7B、C、D
研究意义：在三种体内感染模型中，证实了羟氯扎胺与四环素联用可显著提升感染动物的存活率，大幅降低组织内的细菌载量，验证了该联合方案在体内逆转四环素耐药性、治疗多重耐药菌感染的有效性，为临床转化提供了关键的体内药效支撑。
小鼠感染模型中，不同处理组的炎症因子水平、肺组织 H&E 染色病理变化数据。
数据来源：Supplementary Fig. 4B、C
研究意义：证实了羟氯扎胺与四环素联用可显著缓解细菌感染引发的炎症反应与组织病理损伤，结合其抗毒力活性，明确了该方案不仅能清除病原菌，还能减轻感染引发的宿主损伤，提升治疗效果。
羟氯扎胺与四环素联用的溶血毒性、VERO 细胞毒性数据。
数据来源：Supplementary Fig. 2
研究意义：证实了羟氯扎胺与四环素联用不会增加溶血毒性与真核细胞毒性，验证了该联合方案的体外安全性，为体内实验与临床应用提供了安全依据。
8. 核心研究结论
本研究通过高通量筛选 FDA 批准的上市药物库，首次发现抗寄生虫药物羟氯扎胺可作为新型四环素抗生素佐剂，高效逆转革兰氏阳性与阴性多重耐药菌对四环素的耐药性，使四环素的抗菌活性提升 4~128 倍，对 90 株临床人源和动物源多重耐药菌株均具有良好的协同效应。
羟氯扎胺具有独特的直接杀菌活性，其核心机制是破坏细菌细胞膜的完整性与流动性，诱导细菌胞内 ROS 过量积累，从而发挥快速杀菌作用，该效应是同家族水杨酰苯胺类药物（氯氰碘柳胺、氯硝柳胺）所不具备的。
羟氯扎胺逆转四环素耐药性的核心分子机制为：通过破坏细菌细胞膜电位与质子动力势，抑制细菌氧化磷酸化与能量代谢，降低胞内 ATP 水平，进而抑制 ATP 驱动的四环素外排泵功能，同时下调四环素耐药基因 tet (K) 的转录，最终显著促进四环素在细菌胞内的积累，恢复四环素对耐药菌的杀菌活性。
羟氯扎胺兼具优异的抗毒力活性，其可显著抑制金黄色葡萄球菌关键毒力因子 PVL 与 α- 溶血素的分泌，还能直接与 α- 溶血素高亲和力结合，中和其溶血活性，从而有效缓解细菌感染引发的炎症反应与宿主组织损伤。
羟氯扎胺靶向细菌细胞膜发挥作用，单独或与四环素联用均不易诱导细菌产生耐药性，连续传代 30 天仅使 MIC 提升 2 倍；二者联用在有效浓度范围内无额外的溶血毒性与真核细胞毒性，具有良好的体外生物安全性。
羟氯扎胺与四环素联用在大蜡螟幼虫感染模型、小鼠腹膜炎模型、小鼠皮肤脓肿模型中均表现出优异的体内治疗效果，可显著提升感染动物的存活率，降低组织细菌载量，缓解感染相关的炎症与病理损伤，为临床多重耐药菌感染的治疗提供了一种安全、有效的老药新用方案。
羟氯扎胺兼具直接杀菌、抗生素佐剂、抗毒力三重功能，耐药风险低，临床转化路径清晰，是极具开发潜力的抗耐药菌感染候选药物，其相关研究也为老药新用对抗全球抗生素耐药性危机提供了重要的研究范式。
9. 芬兰 Bioscreen 仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中使用芬兰 Bioscreen C 全自动生长曲线分析仪（Growth Curves, Finland），完成了两大核心实验的微生物生长曲线测定：一是四环素、羟氯扎胺单独及联用处理下金黄色葡萄球菌的 21 小时动态生长曲线测定（对应 Fig.1C）；二是高通量筛选过程中数百个候选克隆在药物胁迫下的生长表型验证。该仪器获得的生长曲线数据是整个研究的重要基础，其核心研究意义分为以下 6 个层面：
核心协同效应的直观、定量、无争议验证
芬兰 Bioscreen 仪器可实现对细菌生长的实时、连续、无人工干预监测，避免了手动分光光度计测定的操作误差、时间间断与环境波动问题。通过该仪器获得的 21 小时高时间分辨率生长曲线数据（Fig.1C），直观且定量地证实了亚抑菌浓度的四环素（32 μg/mL）或羟氯扎胺（0.125 μg/mL）单独使用时，均无法抑制金黄色葡萄球菌的正常生长，而二者联用可完全抑制细菌的生长增殖。该结果是羟氯扎胺与四环素协同抑菌效应最直接的表型证据，为整个研究的开展奠定了不可动摇的核心基础。
高通量筛选体系落地的关键技术支撑
本研究的起点是 1287 种 FDA 化合物的高通量筛选，以及后续优势克隆的初筛与复筛，需要对数百个菌株的生长表型进行平行、快速、定量评估。芬兰 Bioscreen 仪器支持 100 孔板的同步恒温震荡培养与 OD600 自动检测，可同时完成数十至上百个菌株在不同药物浓度下的生长曲线测定，大幅提升了筛选的通量与效率。在羟氯扎胺的初筛与阳性克隆验证过程中，该仪器实现了对候选克隆生长表型的快速、标准化评估，精准锁定了目标化合物，同时高效排除了假阳性克隆，保障了高通量筛选结果的准确性与可靠性，是整个筛选体系能够成功落地的关键技术保障。
实验结果高重复性与严谨性的核心保障
细菌生长曲线测定是抗菌药物活性评估的基础实验，手动测定易受加样误差、培养温度波动、检测时间不一致等因素影响，导致实验重复性差。芬兰 Bioscreen 仪器可提供恒温、恒速震荡的标准化培养环境，对 3 个生物学重复样本进行同步、连续的 OD600 检测，最大限度减少了人为与环境因素带来的系统误差，获得的生长曲线数据具有极高的重复性与稳定性。该数据不仅验证了药物的协同效应，还为后续的 MIC 测定、时间 - 杀菌曲线、分子机制实验提供了标准化的预实验依据，确保了整个研究实验体系的严谨性。
药物抑菌动力学特征的精准解析
该仪器每 1 小时一次的高频率检测，可精准解析羟氯扎胺与四环素联用的抑菌时效特征，明确二者联用从哪个时间点开始抑制细菌生长、完全抑制生长的持续时长、是否存在细菌的恢复性生长等关键动力学信息。相较于仅能反映终点结果的 MIC 测定，动态生长曲线数据能更全面地反映药物的抑菌作用规律，为后续的时间 - 杀菌曲线实验设计、体内给药方案优化提供了关键的时效参考，比如明确药物的作用持续时间，指导体内给药的频率与剂量设定。
机制研究关键实验条件的精准确定
通过 Bioscreen 仪器测定的生长曲线，本研究精准确定了羟氯扎胺与四环素的亚抑菌浓度—— 即单独使用时不影响细菌正常生长、但联用可完全抑制生长的浓度范围。这一浓度基准是后续所有分子机制研究的核心前提：包括胞内抗生素积累检测、膜电位测定、ROS 检测、转录组测序等实验，均采用了该生长曲线验证的亚抑菌浓度。这一设计确保了实验中观察到的分子机制变化，是药物协同作用的特异性结果，而非药物单独杀菌导致细菌死亡带来的非特异性变化，从根本上保障了机制研究结论的科学性与准确性。
菌株生长特性的标准化质控
在耐药性发展实验、临床菌株协同效应验证等实验中，Bioscreen 仪器可对不同菌株、不同传代次数的细菌进行生长曲线测定，实现对菌株生长特性的标准化质控，确保不同实验组的细菌初始接种浓度、生长状态一致，排除了菌株生长差异对药物活性评估结果的干扰，保障了不同批次、不同菌株实验结果的可比性与可靠性。