Diverse Acinetobacter species and Plasmid-Driven spread of carbapenem resistance in pharmaceutical settings in China
中国制药环境中不动杆菌的物种多样性及质粒介导的碳青霉烯耐药性传播
来源：Environment International 198 (2025) 109373
论文整体总结
本研究基于 “One Health” 理念，对中国 9 个地理区域 17 个城市制药生产环境的 29727 份样本开展了大规模系统筛查，共分离获得 94 株非重复不动杆菌菌株，全面解析了该场景下不动杆菌的物种多样性、种群结构、耐药基因组特征与传播规律。研究通过全基因组测序与多相分类学分析，鉴定并命名了 ** 俞云松不动杆菌（Acinetobacter yuyunsongii sp. nov.）与陈欢不动杆菌（Acinetobacter chenhuanii sp. nov.）**2 个不动杆菌新种，完善了该菌属的分类学体系；明确了制药环境分离的不动杆菌传播主要局限于制药场景内部，整体抗菌药物耐药率低于 10%，仅 3 株菌株携带 bla_NDM-1 基因表现出碳青霉烯耐药；同时揭示了制药环境中碳青霉烯耐药性主要由保守的 PTU-Pse8 型接合质粒驱动传播，该类质粒与临床来源同源质粒高度同源，存在跨场景传播的潜在风险。本研究填补了制药环境中不动杆菌大规模系统研究的空白，为 “One Health” 框架下环境源耐药菌的监测、风险评估与防控提供了核心数据与理论支撑。
1. 论文摘要
不动杆菌属因其强大的获得性抗菌药物耐药能力，已成为全球公共卫生的重大隐患。环境储存库在抗菌药物耐药基因（ARGs）和潜在致病菌向临床环境传播的过程中发挥着关键作用。然而，目前针对非临床分离株的研究大多样本量有限，亟需基于 “One Health” 原则开展全面的种群采样，以监测不动杆菌的耐药组与毒力组。本研究在中国制药生产环境中鉴定出 3 株携带 bla_NDM-1 的碳青霉烯耐药不动杆菌，同时发现了 2 个不动杆菌新种。研究从中国 17 个城市的制药生产环境中共分离得到 94 株不动杆菌，可划分为 17 个不同的系统发育簇，包含 2 个新种和 15 个已知种。系统发育分析表明，制药环境分离的不动杆菌主要局限于该环境内传播。基因组分析显示，51 株菌株携带 10 个特定家族的 bla_CHDL（碳青霉烯水解类 D 型 β- 内酰胺酶）基因，3 株菌株携带 bla_NDM-1 基因。所有受试药物的表型耐药率均低于 10%，仅 3 株携带 bla_NDM-1 的菌株表现出碳青霉烯耐药性。bla_NDM-1 基因均位于约 49 kb、骨架保守的 PTU-Pse8 型接合质粒中，其中 pXH1688-NDM 质粒表现出更强的宿主生长适应性与稳定性。通过表型与基因组分析，鉴定出 2 个不动杆菌新种 ——Acinetobacter yuyunsongii sp. nov. 与 Acinetobacter chenhuanii sp. nov.；其中，A. yuyunsongii sp. nov. XH1639 株携带含 bla_OXA-58 的接合质粒，表现出多重耐药表型。本研究完善了不动杆菌属的分类学体系，同时凸显了监测环境源不动杆菌种群动态的紧迫性，亟需采取有效措施降低其向医疗机构传播的风险。
2. 论文关键词
不动杆菌属、制药生产环境、新种、新德里金属β-内酰胺酶1、碳青霉烯水解类D型β-内酰胺酶
3. 研究目的
系统解析中国制药生产环境中不动杆菌的物种多样性、种群结构与地理分布特征，填补该场景下不动杆菌大规模系统研究的空白；
基于 “One Health” 理念，通过全基因组 SNP 溯源分析，探究制药环境源不动杆菌向临床 / 其他环境的跨场景传播潜力，以及在制药场景内的传播规律；
全面解析制药环境不动杆菌的耐药基因组特征，重点阐明碳青霉烯耐药基因 bla_NDM-1、bla_CHDLs 的分布、亚型、遗传背景与水平转移潜力；
结合基因组学与多相表型分析，完成不动杆菌新种的鉴定与系统表征，修正分类学同义名，完善不动杆菌属的基因组分类学体系；
系统评估碳青霉烯耐药质粒的接合转移能力、宿主适应性代价与传代稳定性，揭示制药环境中碳青霉烯耐药性的质粒驱动传播机制；
解析 bla_OXA-58 等 CHDL 基因的表达特征与功能，解释其基因型与碳青霉烯耐药表型不匹配的核心机制。
4. 研究思路
第一步：大规模环境样本采集与菌株分离。2019 年 9 月至 2020 年 4 月，采集中国 9 个地理区域 17 个城市制药厂的 29727 份环境样本，通过选择性培养、16S rDNA Sanger 测序初筛，获得 94 株非重复不动杆菌菌株。
第二步：菌株抗菌药物敏感性表型检测。采用纸片扩散法与肉汤微量稀释法，测定 94 株菌株对 8 类 9 种临床常用抗菌药物的最低抑菌浓度（MIC），统计不同物种的耐药率，明确菌株的整体耐药特征。第三步：全基因组测序与系统发育分析。对 94 株菌株进行 Illumina 二代全基因组测序，对 3 株 bla_NDM-1 阳性株、2 株 bla_OXA-58 阳性株、2 株新种模式株共 7 株重点菌株进行 Nanopore 三代测序，完成完整基因组完成图组装；通过核心基因组系统发育分析明确菌株的物种分类，鉴定新种；通过全基因组 SNP 距离分析，探究菌株的种内传播事件与跨场景传播风险。第四步：耐药基因组与移动遗传元件解析。通过基因组注释与耐药基因分析，明确菌株中碳青霉烯耐药基因及其他类别耐药基因的分布、亚型；重点解析耐药质粒的完整结构、序列同源性、接合转移模块与耐药基因的侧翼遗传环境，揭示耐药基因的水平转移机制。第五步：不动杆菌新种的多相分类学鉴定。对 2 个新种的模式菌株开展系统的表型表征，包括透射电镜形态观察、生长条件（温度、pH、NaCl 耐受性）测定、生理生化特征（API、Biolog 系统）分析、细胞脂肪酸、极性脂与呼吸醌组成检测；结合 ANI、isDDH 基因组同源性分析，完成新种的分类学命名与有效发表。第六步：耐药质粒的生物学功能验证。通过接合转移实验验证耐药质粒的可转移性；通过无抗连续传代实验测定质粒的遗传稳定性；利用芬兰 Bioscreen C 仪器测定携带质粒的接合子生长曲线，评估质粒对宿主的适应性代价；通过基因克隆实验验证 bla_OXA-58 基因的耐药功能，结合 qRT-PCR 测定耐药基因的 mRNA 表达水平，解释基因型与表型的差异机制。
第七步：结果整合与结论提炼。综合所有实验数据，明确制药环境中不动杆菌的多样性、传播特征与碳青霉烯耐药风险，完善不动杆菌分类学体系，提出环境源耐药菌监测与防控的核心方向。
5. 研究亮点
研究规模与场景的突破性：首次对中国跨 17 个城市的制药生产环境开展了迄今为止样本量最大、覆盖范围最广的不动杆菌系统调查，填补了制药这一特殊关键场景中不动杆菌多样性与耐药性研究的空白，为 “One Health” 框架下环境耐药菌监测提供了关键的基础数据。
不动杆菌分类学的重要更新：鉴定并系统表征了 2 个不动杆菌新种（A. yuyunsongii sp. nov.、A. chenhuanii sp. nov.），同时修正了不动杆菌属 13 对分类学同义名，完善了该菌属的基因组分类学体系，为不动杆菌的物种鉴定与进化研究提供了新的参考。
传播规律的全新认知：通过全基因组高分辨率 SNP 分析，明确制药环境分离的不动杆菌传播主要局限于制药生产场景内部，仅存在极少数地理邻近城市的跨区域传播，未发现向临床环境的有效传播，修正了对环境源不动杆菌跨场景传播风险的传统认知，为耐药菌的精准防控提供了理论依据。
耐药传播机制的深度解析：首次在制药环境不动杆菌中发现携带 bla_NDM-1 的 PTU-Pse8 型接合质粒，明确了该类质粒的保守骨架与临床来源质粒的高度同源性，证实了其高效的接合转移能力，揭示了制药环境与临床环境间耐药质粒的潜在关联与传播链条；同时阐明了 bla_OXA-58 基因的低表达是宿主菌株未表现碳青霉烯耐药的核心机制，解决了长期以来 CHDL 基因阳性菌株表型敏感的科学问题。
质粒生物学特性的新发现：发现 3 株骨架高度同源的 bla_NDM-1 质粒，在宿主适应性代价与传代稳定性上存在显著差异，其中 pXH1688-NDM 表现出更低的宿主生长抑制与更高的质粒稳定性，明确了质粒细微序列变异对其环境存续能力的调控作用，为耐药质粒的适应性进化研究提供了全新的实验证据。
研究范式的标准化建立：构建了从大规模环境样本分离、全基因组溯源、耐药基因解析到新种多维度鉴定的完整研究体系，建立了基于 Bioscreen 生长曲线的质粒适应性标准化评估方法，为 “One Health” 框架下不同场景环境源耐药菌的系统监测提供了可复制的研究范式。
6. 可延伸的研究方向
耐药质粒适应性进化的分子机制研究：针对同源 bla_NDM-1 质粒的宿主适应性差异，深入解析 IV 型分泌系统、磷酸盐转运基因、转录调控因子等序列变异对质粒稳定性、宿主代谢负担的调控机制，揭示耐药质粒在不动杆菌中的适应性进化规律。
制药环境不动杆菌的长期纵向动态监测：开展多时间维度的连续监测，探究制药生产过程中消毒措施、抗菌药物残留、生产工艺变化等因素对不动杆菌种群结构、耐药基因丰度的长期影响，建立制药环境耐药菌流行风险的预警模型。
新种的致病性与临床风险评估：针对 2 个新发现的不动杆菌新种，系统开展毒力因子鉴定、生物膜形成能力、宿主细胞黏附与侵袭能力、动物感染模型等研究，评估其作为机会致病菌的临床感染风险与致病机制。
制药环境耐药基因传播的驱动因子研究：模拟制药生产的真实环境条件，探究温度、pH、消毒剂残留、微量抗菌药物、营养条件等环境因子对耐药质粒接合转移效率的影响，明确制药环境中耐药基因水平转移的关键驱动因素。
耐药菌跨场景溯源技术体系开发：基于本研究的基因组数据，开发制药环境源不动杆菌与耐药质粒的特异性溯源标记，建立可区分临床、环境、制药、养殖来源不动杆菌的全基因组溯源体系，为耐药菌的全链条传播溯源提供技术支撑。
制药环境耐药菌防控技术研发：针对制药环境中不动杆菌的生存与传播特征，开发靶向的环境消毒、生物防控、洁净区微生物控制技术，降低耐药菌在制药环境中的定植与传播风险，保障药品生产安全与公共卫生安全。
CHDL 基因的表达调控机制研究：针对 bla_OXA-58 等 CHDL 基因的宿主特异性表达特征，深入解析插入序列、启动子区域、宿主转录调控因子对其表达水平的影响，阐明不动杆菌中 CHDL 基因的耐药表达调控网络。
7. 测量数据、研究意义及对应图表
制药环境样本的不动杆菌检出率与地理分布数据：测量了中国 17 个城市 29727 份制药环境样本的不动杆菌整体阳性率、各地区阳性率、菌株分离数量与地理分布特征。研究意义：明确了制药环境中不动杆菌的整体流行水平为 0.3%，厘清了不同地区制药环境不动杆菌污染的差异特征，为后续研究奠定了核心样本基础。数据来自Fig.1A、Fig.1B。
94 株不动杆菌的核心基因组系统发育与耐药基因分布数据：基于核心基因组构建了 94 株菌株的系统发育树，明确了菌株的物种聚类特征，同步关联了碳青霉烯耐药基因的分布情况。研究意义：厘清了制药环境不动杆菌的物种多样性，确定了 15 个已知种与 2 个新种的分类地位，同时揭示了不同不动杆菌物种的耐药基因携带规律。数据来自Fig.1C。
不动杆菌新种的系统发育基因组学数据：构建了 2 株新种模式菌株与不动杆菌属 85 个有效发表种、62 个未命名分类单元的核心基因组系统发育树，测定了新种与近缘种的平均核苷酸一致性（ANI）、数字 DNA-DNA 杂交（isDDH）值。研究意义：从基因组水平证实了 2 株菌株为不动杆菌属的新种，明确了其系统发育地位，为不动杆菌属的分类学更新提供了金标准级别的基因组证据。数据来自Fig.2、Table2。
94 株不动杆菌的抗菌药物敏感性数据：测定了 8 类 9 种抗菌药物对 94 株菌株的 MIC50、MIC90，以及不同不动杆菌物种对各药物的耐药率。研究意义：明确了制药环境不动杆菌的整体耐药水平极低，所有受试药物的耐药率均低于 10%，仅 3 株菌株表现出碳青霉烯耐药，为制药环境不动杆菌的耐药风险评估提供了全面的表型数据支撑。数据来自Table1。
不动杆菌菌株的全基因组 SNP 距离数据：分别计算了制药环境菌株间、制药环境菌株与 NCBI 数据库中临床 / 其他环境菌株间的全基因组 SNP 距离，分析了潜在的传播事件。研究意义：揭示了制药环境不动杆菌的传播主要局限于制药场景内部，仅存在极少数跨城市传播事件，未发现向临床环境的有效传播，明确了其传播特征与跨场景传播风险。数据来自Fig.3A、Fig.3B、补充信息 Table S7。
bla_NDM-1 携带质粒的基因组结构与比较基因组数据：完成了 3 株 bla_NDM-1 质粒的完整测序与功能注释，开展了质粒的全序列比对、遗传环境分析，明确了质粒的骨架结构、插入序列组成与耐药基因的侧翼序列。研究意义：阐明了制药环境中 bla_NDM-1 基因均位于骨架高度保守的 PTU-Pse8 型接合质粒中，揭示了其与临床来源质粒的高度同源性，明确了该类质粒的水平转移潜力与传播机制。数据来自Fig.4、Table3。
bla_OXA-58 携带质粒的基因组结构与遗传环境数据：完成了 2 株 bla_OXA-58 质粒的完整测序、注释与序列比对，分析了 bla_OXA-58 基因的侧翼插入序列与遗传结构单元。研究意义：明确了 bla_OXA-58 基因的核心遗传背景，发现了其上游插入序列的差异特征，为解释其表达水平与耐药表型差异提供了直接的基因组证据。数据来自Fig.5A、Fig.5B、Fig.5C、Table3。
耐药质粒的生物学特性数据：通过接合实验测定了质粒的接合转移能力；通过连续传代实验测定了质粒在无抗生素条件下的遗传稳定性；通过芬兰 Bioscreen C 仪器测定了携带质粒的接合子的生长速率与生长曲线。研究意义：明确了所有受试耐药质粒均具备接合转移能力，量化了质粒对宿主造成的适应性代价，发现了同源质粒在稳定性与宿主适应性上的显著差异，揭示了质粒在环境中存续与传播的核心生物学基础。数据来自Fig.6A、Fig.6B、补充信息 Table S8。
碳青霉烯耐药基因的相对表达水平数据：通过 qRT-PCR 测定了 bla_NDM-1、bla_OXA-23、bla_OXA-58、bla_OXA-235 等碳青霉烯耐药基因的相对 mRNA 表达量。研究意义：明确了 bla_OXA-58 等 CHDL 基因的表达水平显著低于 bla_NDM-1，从转录水平解释了仅携带 bla_NDM-1 的菌株表现出碳青霉烯耐药表型的核心机制。数据来自Fig.6C。
bla_OXA-58 重组菌株的抗菌药物 MIC 数据：将不同遗传背景的 bla_OXA-58 结构单元克隆至大肠杆菌 DH5α 与鲍曼不动杆菌 ATCC 17978 中，测定了重组菌株对碳青霉烯类、头孢类药物的 MIC 值。研究意义：证实了 ΔISAba3-bla_OXA-58 结构单元可在不动杆菌中赋予碳青霉烯耐药性，而在大肠杆菌中无此功能，明确了该耐药基因的宿主特异性表达特征。数据来自Table4。
不动杆菌新种的多相表型特征数据：通过透射电镜测定了新种菌株的细胞形态与大小；测定了菌株的最适生长温度、pH 范围、NaCl 耐受浓度；通过 API 20NE、API ZYM、Biolog GEN III 系统测定了生化特征；分析了菌株的细胞脂肪酸、极性脂与呼吸醌组成。研究意义：完成了 2 个新种的全面多相分类学鉴定，为不动杆菌属的分类学提供了标准化的表型数据，完善了新种的生物学特征描述。数据来自补充信息 Fig.S1~Fig.S5、补充信息 Table S4、Table S5。
8. 核心研究结论
中国制药生产环境中存在高度多样的不动杆菌属菌株，94 株分离株可划分为 17 个物种，包含 15 个已知种与 2 个新鉴定的不动杆菌新种（A. yuyunsongii sp. nov.、A. chenhuanii sp. nov.），其中临床常见的皮特不动杆菌、医院不动杆菌、鲍曼不动杆菌为该场景下的优势物种。
制药环境分离的不动杆菌整体抗菌药物耐药率处于极低水平，所有受试抗菌药物的耐药率均低于 10%；仅 3 株分别属于抗辐射不动杆菌、医院不动杆菌、皮特不动杆菌的菌株携带 bla_NDM-1 基因，表现出碳青霉烯耐药表型；51 株菌株携带 10 个家族的 CHDL 编码基因，但未表现出碳青霉烯耐药。
制药环境中的不动杆菌传播主要局限于制药生产场景内部，仅存在极少数地理邻近城市的跨区域传播事件，未发现其向临床或其他环境的有效传播，表明该类菌株对制药环境具有高度的宿主适应性，跨场景传播能力有限。
制药环境中不动杆菌的碳青霉烯耐药性主要由质粒驱动传播：bla_NDM-1 基因均位于约 49 kb、骨架高度保守的 PTU-Pse8 型接合质粒中，该类质粒与临床来源的 bla_NDM-1 质粒高度同源，具备高效的接合转移能力，存在从制药环境向临床环境传播的潜在公共卫生风险。
骨架高度同源的 bla_NDM-1 质粒表现出显著的生物学特性差异：pXH1688-NDM 质粒相较于另外 2 株同源质粒，对宿主菌造成的适应性代价更低，在无抗生素选择压力的条件下遗传稳定性更高，具备更强的环境存续与传播优势。
携带 bla_OXA-58 的接合质粒未赋予宿主菌株碳青霉烯耐药表型，核心原因是 bla_OXA-58 基因的 mRNA 转录水平显著低于 bla_NDM-1；功能克隆实验证实，ΔISAba3-bla_OXA-58 结构单元可在鲍曼不动杆菌中赋予碳青霉烯耐药性，其耐药表型具有显著的宿主物种特异性。
新鉴定的 A. yuyunsongii sp. nov. XH1639 株携带含 bla_OXA-58 的接合质粒，表现出多重耐药表型，需持续监测其在环境中的流行与传播风险；本研究的发现完善了不动杆菌属的分类学体系，凸显了对制药环境等非临床场景中不动杆菌与耐药基因开展常态化、全流程监测的紧迫性。
9. 芬兰 Bioscreen 仪器测量的微生物生长曲线数据详细解读
（1）测量基础信息
测量仪器：芬兰 Bioscreen C MBR 全自动微生物生长曲线分析仪（Oy Growth Curves Ab Ltd., Finland）
数据对应图表：Fig.6A
测量对象：① 利福平耐药的鲍曼不动杆菌受体菌株 ATCC 17978RIFR；② 分别携带 5 种耐药质粒（pXH1688-NDM、pXH1727-NDM、pXH1728-NDM、pXH1639-OXA、pXH1679-OXA）的鲍曼不动杆菌接合子
测量参数：37℃振荡培养，每 5 分钟测定一次 OD600 值，持续监测 20h，基于生长曲线计算菌株的比生长速率，通过单因素 ANOVA 与 Tukey 多重检验进行统计学差异分析
核心测量结果：所有携带耐药质粒的接合子，生长速率均显著低于受体菌株 ATCC 17978RIFR；其中携带 pXH1688-NDM 质粒的接合子生长速率显著高于携带另外 2 株 bla_NDM-1 质粒的接合子，表明该质粒对宿主造成的适应性代价显著更低。
（2）该数据的核心研究意义
精准量化了耐药质粒对宿主菌的适应性代价，揭示了质粒环境存续的核心生物学基础
细菌获得外源耐药质粒通常会产生额外的代谢负担，造成生长适应性下降，而适应性代价的高低直接决定了质粒在宿主菌中的长期存续能力与环境传播潜力。Bioscreen 仪器的高通量、高频率全自动监测特性，完全避免了人工取样的系统误差，精准绘制了不同质粒宿主的全周期生长曲线，量化了生长速率的细微差异。该数据不仅明确了所有受试耐药质粒均会对宿主产生适应性代价，更发现了骨架高度同源的 bla_NDM-1 质粒在适应性代价上存在显著差异，从生长生理学角度直接解释了为何 pXH1688-NDM 质粒在传代实验中表现出更高的稳定性，为理解耐药质粒在制药低选择压力环境中的存续、进化与传播优势提供了核心的实验证据。
完善了耐药质粒的传播风险评估体系，为风险分级提供了关键定量指标
传统的耐药质粒风险评估，往往仅关注质粒的接合转移能力与耐药基因的类型，而忽略了质粒的宿主适应性对其环境传播与流行的决定性影响。Bioscreen 测得的生长速率数据，补充了质粒生物学特性的关键评估维度：即使质粒具备高效的接合转移能力，若其对宿主造成过高的适应性代价，也难以在无抗生素选择压力的制药环境中长期存续与传播。本研究中，pXH1727-NDM 与 pXH1728-NDM 质粒虽可高效转移，但对宿主生长抑制更强、稳定性更低，其环境传播风险显著低于适应性更强的 pXH1688-NDM 质粒。这一数据为制药环境中耐药质粒的风险分级与精准防控提供了定量依据，弥补了传统风险评估仅关注耐药表型的核心不足。
验证了质粒序列变异对宿主适应性的调控作用，为耐药质粒进化研究指明了方向
3 株 bla_NDM-1 质粒具有高度保守的骨架，仅在 IV 型分泌系统、磷酸盐转运相关基因、转录调控因子等区域存在细微序列差异，却表现出显著不同的宿主适应性。Bioscreen 测得的生长速率差异，直接证实了质粒的细微序列变异可显著影响其对宿主的代谢负担。这一结果为后续研究锁定了关键的候选基因区域，为解析质粒 - 宿主互作的分子机制、揭示耐药质粒在环境中的适应性进化规律提供了明确的实验方向，同时也为预测耐药质粒的进化趋势与流行潜力提供了可验证的实验支撑。
建立了标准化的质粒适应性评估方法，为 “One Health” 耐药菌监测提供了统一技术范式
Bioscreen 仪器的高通量特性，可同时完成多株菌株、多生物学重复的生长曲线同步测定，实验重复性高、数据稳定，解决了传统试管培养、分光光度计人工测定方法通量低、误差大、操作繁琐的问题。本研究基于该仪器建立的耐药质粒宿主适应性评估方法，可标准化应用于临床、环境、养殖等不同场景的耐药质粒研究中，为 “One Health” 框架下，跨场景耐药质粒的适应性与传播风险的横向比较提供了统一的技术标准，推动了耐药菌全链条监测的标准化与规范化。
为制药环境耐药菌的防控策略制定提供了直接的科学依据
制药生产环境需严格控制微生物污染与耐药菌传播，而 Bioscreen 测得的生长数据，明确了耐药质粒的宿主适应性是其在环境中长期存续的关键因素。这一结果提示，在制药环境的消毒与防控中，除了杀灭耐药菌、降低抗菌药物选择压力外，还需重点关注高适应性、高稳定性耐药质粒的监测与源头阻断；同时，低适应性代价的耐药质粒即使在低选择压力环境中也可长期存续，凸显了制药环境全流程、常态化耐药监测的必要性，为制药企业制定针对性的耐药菌防控措施、保障药品生产安全提供了科学支撑。