Impact of Stropharia rugosoannulata extract on Lactobacillus reuteri HBM11-69 growth, metabolism and mechanisms
大球盖菇提取物对罗伊氏乳杆菌 HBM11-69 生长、代谢的影响及其作用机制
来源：LWT - Food Science and Technology 201 (2024) 116175
1. 论文摘要
为促进罗伊氏乳杆菌的生长增殖，本研究首先通过单因素实验与响应面法优化了该菌株的培养基配方，随后以大球盖菇水提物（WES）作为罗伊氏乳杆菌 HBM11-69 的生长促进剂，探究其对菌株生长与代谢的影响，同时利用转录组学技术分析菌株的基因表达变化及潜在作用机制。结果显示，经单因素实验与响应面法优化后，获得了罗伊氏乳杆菌 HBM11-69 的最优培养基配方，菌株活菌数较传统 MRS 培养基提升 5 倍；在优化培养基中添加 20 g/L WES 时，菌株生长状态最佳，活菌数可达 1.41×10¹⁰ CFU/mL，同时发酵液中短链脂肪酸含量也达到最高水平。对 WES 添加前后的菌株进行转录组分析发现，BSU40060、BSU33510、spr1465、BSU22120 等差异表达基因显著上调；WES 促进罗伊氏乳杆菌 HBM11-69 增殖的作用，与葡萄糖激酶、重金属相关结构域蛋白及磷脂酸生物合成过程密切相关。
2. 论文关键词
生长增殖、单因素实验、响应面法、短链脂肪酸、转录组学
3. 研究目的
通过单因素实验结合响应面法，优化罗伊氏乳杆菌 HBM11-69 的发酵培养基配方，实现菌株高密度培养，大幅提升活菌数，为该菌株的工业化发酵提供核心配方支撑。
探究大球盖菇水提物（WES）对罗伊氏乳杆菌 HBM11-69 生长、代谢的调控作用，筛选出促进菌株增殖的最佳 WES 添加浓度，明确其对菌株短链脂肪酸代谢的影响。
基于转录组学技术，系统解析 WES 促进罗伊氏乳杆菌 HBM11-69 增殖的分子机制，锁定关键差异表达基因与核心调控通路，为食用菌提取物作为益生元的开发与应用提供理论依据。
4. 研究思路
培养基系统优化阶段：以传统 MRS 培养基为基础，通过单因素实验，分别考察碳源、氮源、生长因子、缓冲盐、微量元素五大类组分对罗伊氏乳杆菌 HBM11-69 生长的影响，筛选出最优培养基组分及浓度范围；再通过 Plackett-Burman 实验筛选对菌株生长影响显著的关键因子，结合 Box-Behnken 设计与响应面法构建菌株高密度生长的回归模型，确定最优培养基配方，并通过实验验证模型可靠性与活菌数提升效果。
WES 益生作用验证阶段：制备大球盖菇子实体水提物 WES，测定其多糖与蛋白核心成分含量；在优化后的培养基中添加不同浓度梯度的 WES，通过测定菌液 OD₆₀₀值、平板菌落计数，明确 WES 对菌株增殖的浓度效应及最佳添加量；通过 GC-MS 技术检测发酵液中短链脂肪酸的组成与含量，分析 WES 对菌株核心代谢产物的影响。
分子机制深度解析阶段：以 20 g/L WES 处理组为实验组，无 WES 添加组为对照组，进行 3 次生物学重复的转录组测序，筛选显著差异表达基因；通过 GO 功能注释与 KEGG 通路富集分析，明确差异基因的生物学功能与参与的核心代谢通路；通过 qRT-PCR 对关键差异基因进行表达水平验证，最终阐明 WES 促进罗伊氏乳杆菌增殖的完整分子机制。
5. 研究亮点
填补了研究领域空白：首次系统探究并证实了大球盖菇水提物对罗伊氏乳杆菌的增殖促进作用，拓展了大球盖菇这一 FAO 推荐栽培食用菌的高值化应用场景，为食用菌来源益生元的开发提供了全新的研究方向与实验支撑。
实现了菌株高密度培养的重大突破：通过单因素实验结合响应面法，获得了罗伊氏乳杆菌 HBM11-69 的最优培养基配方，优化后菌株活菌数可达 1.15×10¹⁰ CFU/mL，是传统 MRS 培养基的 5 倍，为该菌株的工业化发酵生产提供了精准、高效的培养基体系。
多维度揭示了 WES 的益生价值：证实 WES 不仅能显著提升罗伊氏乳杆菌的活菌数，还能特异性提升发酵液中丁酸、戊酸等有益短链脂肪酸的含量，实现了益生菌活菌数与功能代谢产物的双重提升，为合生元产品的开发提供了兼具增殖与功能强化的双重优势。
系统解析了分子调控机制：结合转录组学技术，从基因表达层面锁定了 WES 调控菌株增殖的 4 个关键上调基因与 3 大核心代谢通路（磷酸戊糖途径、矿物质吸收、甘油磷脂代谢），完整阐明了 WES 促进罗伊氏乳杆菌生长的分子机制，为食用菌益生功能的机制研究提供了全新的理论框架。
研究成果具备强转化潜力：优化的培养基配方与 WES 的应用方案均基于食品级原料，工艺简单、成本可控，可直接应用于益生菌发酵生产与功能食品开发，兼具学术价值与产业化应用前景。
6. 可延伸的研究方向
核心活性成分的分离与构效关系研究：进一步分离纯化 WES 中的多糖、多肽等单一组分，明确促进罗伊氏乳杆菌增殖的核心活性物质，解析其结构特征与益生活性的构效关系，为高活性益生元产品的开发奠定物质基础。
工业化发酵工艺放大与产品开发：基于优化后的培养基配方，开展罗伊氏乳杆菌 HBM11-69 的发酵罐中试与放大实验，优化发酵温度、pH、溶氧、补料策略等工艺参数；开发以 WES 为益生元、罗伊氏乳杆菌为核心的合生元功能食品、饲料添加剂等产品，实现研究成果的产业化转化。
作用机制的深度验证与拓展：通过基因敲除 / 过表达技术，验证 BSU40060、BSU33510 等关键基因在 WES 促增殖中的核心功能；结合蛋白质组学、代谢组学等多组学技术，构建 WES 调控罗伊氏乳杆菌生长代谢的完整分子网络，进一步完善作用机制的解析。
益生作用的广谱性与体内功效验证：探究 WES 对双歧杆菌、植物乳杆菌等其他常见益生菌的增殖作用，明确其益生作用的广谱性；通过动物体内实验，验证 WES 与罗伊氏乳杆菌联用对肠道菌群结构、肠道屏障功能、机体免疫水平的调节作用，同时开展毒理学实验评估其应用安全性。
制备工艺的优化与活性提升：探究超声辅助提取、酶解提取、复合酶解等不同工艺对 WES 活性成分含量与益生活性的影响，优化 WES 的绿色、高效制备工艺；同时研究不同加工处理（高温、辐照、高压）对 WES 益生活性的影响，保障其在食品加工过程中的活性稳定性。
7. 测量数据、对应图表及研究意义
不同碳源、氮源、生长因子、缓冲盐、微量元素对罗伊氏乳杆菌 HBM11-69 生长的影响数据，包括不同组分种类及浓度梯度下的菌液 OD₆₀₀值。
数据来源：Fig. 1 Single-factor experiments to analyze the effects of different factors on the high-density growth of L. reuteri HBM11-69.（A-L 子图）
研究意义：系统筛选出适合菌株高密度生长的最优培养基组分，确定蔗糖为最佳碳源、酵母提取物复合大豆蛋白胨为最佳氮源，同时明确了甘油、L - 半胱氨酸、柠檬酸氢二铵、MgSO₄等组分的最优添加范围，为后续响应面优化实验奠定了核心基础，清晰揭示了培养基各组分对菌株生长的影响规律。
Plackett-Burman 实验的设计与方差分析数据、Box-Behnken 实验的回归模型方差分析数据，以及三因素交互作用的响应面图数据。
数据来源：Table 1 ANOVA of the central composite design.、Fig. 2 Response surface plots of the effect of factor interactions on L. reuteri HBM11-69 high-density growth.（A、B、C 子图）、Supplementary Tables 1-6
研究意义：通过 Plackett-Burman 实验筛选出蔗糖、酵母提取物、柠檬酸氢二铵三个对菌株生长影响显著的关键因子；构建了菌株高密度生长的二次回归模型，验证了模型的高可靠性（R²=0.9479）与良好拟合度；通过响应面图明确了各因素间的交互作用对菌株生长的影响，最终获得了菌株高密度生长的最优培养基配方，实现了活菌数较 MRS 培养基提升 5 倍的效果，为该菌株的工业化高密度发酵提供了精准的配方依据。
罗伊氏乳杆菌 HBM11-69 的 24 小时动态生长曲线数据，不同浓度 WES 处理下菌株的生长密度 OD₆₀₀值与活菌数数据。
数据来源：Fig. 3 Effect of WES on the growth of L. reuteri HBM11-69.（A、B、C 子图）
研究意义：明确了菌株的完整生长规律，确定 24 小时为发酵终点；证实了 WES 对菌株增殖的浓度依赖性效应，20 g/L 为最佳添加浓度，此时活菌数最高可达 1.41×10¹⁰ CFU/mL，而 50-60 g/L 高浓度 WES 会抑制菌株生长，为 WES 在益生菌发酵中的应用提供了精准的浓度参考，直接证实了 WES 对罗伊氏乳杆菌的增殖促进作用。
WES 处理组与对照组发酵液中 6 种短链脂肪酸（乙酸、丙酸、异丁酸、丁酸、异戊酸、戊酸）的定量检测数据。
数据来源：Table 2 Short-chain fatty acid content of fermentation broth (μg/mL).
研究意义：证实了 20 g/L WES 可使发酵液中丁酸、戊酸含量分别显著提升 9.30% 和 43.92%，对其他短链脂肪酸无显著影响；明确了 WES 不仅能促进菌株增殖，还能调控其代谢过程，提升有益短链脂肪酸的产量，为该菌株与 WES 联用的肠道健康益处提供了代谢层面的核心支撑。
WES 处理组与对照组的差异表达基因统计数据，包括差异基因数量、上下调分布的火山图数据。
数据来源：Fig. 4 Differential statistics of DEGs expression.
研究意义：明确了 WES 处理后菌株共鉴定出 27 个差异表达基因，其中 6 个上调、21 个下调，说明 WES 对菌株基因表达的调控具有靶向性，影响范围集中，为后续功能富集分析与关键基因筛选提供了基础数据。
差异表达基因的 GO 功能注释与富集分析数据、KEGG 通路富集分析数据。
数据来源：Fig. 5 GO and KEGG enrichment analysis of DEGs.（A、B、C 子图）
研究意义：通过 GO 注释明确了差异基因主要富集在生物过程、细胞组分、分子功能三大类别，核心聚焦于代谢过程、催化活性、细胞过程等功能；通过 KEGG 富集分析筛选出磷酸戊糖途径、甘油磷脂代谢、ABC 转运体等 13 个显著富集的通路，锁定了 WES 调控菌株生长代谢的核心通路，为分子机制解析提供了关键的通路层面依据。
4 个关键差异表达基因（BSU33510、BSU22120、BSU40060、spr1465）的 qRT-PCR 验证数据。
数据来源：Fig. 6 QRT-PCR validation of DEGs.
研究意义：验证了 4 个关键基因在 WES 处理组中均显著上调，与转录组测序结果完全一致，证实了转录组数据的可靠性与准确性，明确了这 4 个基因是 WES 促进菌株增殖的核心调控基因。
关键差异表达基因参与的潜在代谢通路模型数据。
数据来源：Fig. 7 Potential metabolic pathways for important differentially expressed genes.
研究意义：直观呈现了 4 个关键基因分别通过磷酸戊糖途径、矿物质吸收、甘油磷脂代谢通路调控菌株生长的分子机制，将基因表达变化与代谢通路调控进行了系统关联，完整阐释了 WES 促进罗伊氏乳杆菌增殖的核心分子机制。
WES 的核心成分含量数据，包括多糖含量 456.98 mg/g、蛋白含量 273.11 mg/g。
数据来源：正文 3.3 章节
研究意义：明确了 WES 的核心活性成分为多糖和蛋白，二者占干重比例分别达 45.7% 和 27.31%，为后续活性成分的分离纯化与构效关系研究提供了基础数据。
8. 核心研究结论
经单因素实验结合响应面法优化，获得了罗伊氏乳杆菌 HBM11-69 的高密度生长最优培养基配方，优化后菌株活菌数可达 1.15×10¹⁰ CFU/mL，是传统 MRS 培养基的 5 倍，成功实现了该菌株的高效高密度培养。
大球盖菇水提物（WES）对罗伊氏乳杆菌 HBM11-69 的增殖具有浓度依赖性调控作用，20 g/L 为最佳添加浓度，此时菌株活菌数最高可达 1.41×10¹⁰ CFU/mL；同时该添加量可显著提升发酵液中丁酸、戊酸等有益短链脂肪酸的含量，实现了菌株增殖与功能代谢的双重优化。
转录组学分析证实，WES 处理可诱导罗伊氏乳杆菌 HBM11-69 的 BSU40060、BSU33510、spr1465、BSU22120 四个关键基因显著上调，这些基因主要参与磷酸戊糖途径、矿物质吸收、甘油磷脂代谢三大核心代谢通路，这是 WES 促进菌株增殖的核心分子机制。
本研究证实大球盖菇水提物具备良好的益生元潜力，可作为罗伊氏乳杆菌的高效增殖促进剂，为食用菌资源的高值化利用、益生菌高密度发酵技术优化，以及合生元功能食品的开发提供了重要的理论依据与实验支撑。
9. 芬兰 Bioscreen 仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中，芬兰 Bioscreen C 全自动生长曲线仪（Oy Growthcurves Ab Ltd, Helsinki, Finland）被用于测定罗伊氏乳杆菌 HBM11-69 的动态生长曲线，对应Fig.3A，该仪器获得的生长曲线数据是整个研究的重要基础，其核心研究意义分为以下 6 个层面：
精准刻画菌株生长规律，确定实验关键时间节点
Bioscreen 仪器可实现 37℃恒温环境下，对菌株生长的全自动、高频率（每小时 1 次）、无人工干预的 OD₆₀₀实时监测，彻底避免了手动分光光度计测定带来的操作误差、时间间断与环境波动问题。通过该仪器获得的 24 小时连续生长曲线数据，精准刻画了罗伊氏乳杆菌 HBM11-69 的延滞期、对数生长期、稳定期的完整生长动力学特征，明确了菌株在 24 小时进入稳定期，菌液 OD₆₀₀值与活菌数达到峰值。这一结果为后续高密度发酵的终点时间确定、WES 添加时机选择、活菌数与代谢产物检测的时间节点设定提供了最直接、最精准的实验依据，保障了后续所有实验条件的标准化与一致性。
为培养基优化实验提供核心的表型评价基准
本研究的核心基础是培养基的单因素优化与响应面优化，而菌株的生长速率与最终生物量是评价培养基优劣的核心指标。Bioscreen 仪器可同时对 100 个样品进行平行、同步培养与检测，保证了不同碳源、氮源、添加剂实验组的培养环境完全一致，消除了批次间的系统误差，使得单因素实验中不同组分对菌株生长的影响评价更具客观性与准确性。基于该仪器获得的生长数据，研究才能精准筛选出最优的培养基组分与浓度范围，为后续 Plackett-Burman 实验的因子筛选、Box-Behnken 实验的水平设定提供了可靠的表型数据支撑，是整个培养基优化体系能够成功的关键技术基础。
保障 WES 增殖作用评价的准确性与重复性
在探究不同浓度 WES 对菌株生长的影响实验中，Bioscreen 仪器提供的生长曲线数据，可实现对菌株生长全过程的动态监测，不仅能获得终点的 OD₆₀₀值，还能分析 WES 对菌株延滞期时长、对数生长期比生长速率的影响，全面评价 WES 对菌株生长的调控作用，而非仅依靠终点活菌数的单一指标。同时，该仪器的多平行样同步检测特性，大幅提升了实验数据的重复性与可靠性，使得研究能精准区分不同浓度 WES 对菌株生长的促进 / 无影响 / 抑制效应，最终锁定 20 g/L 为最佳添加浓度，为 WES 的益生作用验证提供了严谨、可重复的实验数据。
为菌株工业化发酵生产提供关键的工艺参数基础
Bioscreen 仪器测定的生长曲线数据，完整反映了罗伊氏乳杆菌 HBM11-69 的生长动力学特征，包括比生长速率、最大生物量、稳定期持续时间、对数生长期时长等关键发酵工艺参数。这些数据是后续发酵罐放大实验的核心基础，可直接用于指导工业化发酵过程中的接种量、溶氧控制、pH 调控、补料策略、发酵终点控制等关键工艺参数的设定，大幅缩短了从实验室优化到工业化生产的工艺开发周期，为该菌株的产业化应用提供了关键的动力学数据支撑。
为分子机制研究提供标准化的实验条件保障
转录组学分析、qRT-PCR 验证等分子机制实验，对菌株的生长状态、取样时间点的一致性要求极高，生长阶段的差异会导致大量非特异性的基因表达变化，严重干扰实验结果的准确性。通过 Bioscreen 仪器获得的精准生长曲线，研究可严格控制实验组与对照组的菌株均处于相同的对数生长期 / 稳定期取样，完全消除了因生长状态差异带来的基因表达非特异性变化，保障了转录组测序结果能真实反映 WES 对菌株的特异性调控作用，而非生长阶段差异带来的干扰，从根本上提升了分子机制研究结论的科学性与准确性。
为菌株的功能稳定性评价提供了标准化方法
罗伊氏乳杆菌作为益生菌，其生长性能的稳定性是产品质量的核心指标。Bioscreen 仪器提供的标准化生长曲线测定方法，可实现对不同批次、不同保藏时间、不同处理条件下菌株生长性能的快速、精准评价，为后续菌株的菌种保藏、传代稳定性、产品货架期评价提供了标准化的技术方法，保障了该菌株后续产品开发的质量可控性。