Adaptive evolution of engineered Saccharomyces cerevisiae in favored and unusual chemical environments
工程化酿酒酵母在偏好与非寻常化学环境中的适应性进化
来源：Metabolic Engineering 96 (2026) 255–267
摘要
利用工程化微生物细胞以可再生资源生产化学品有望替代石油基化学合成，然而达尔文选择对工程菌化学品生产能力的影响尚未被充分探究。所有增殖细胞都不可避免地受到达尔文选择的作用，该选择偏好利于细胞适应性的表型，而这类表型极少包含工程化的化学品生产性状。
本研究通过适应性实验室进化（ALE），表征了达尔文选择对分别表达两种异源色素合成途径（蓝色靛蓝啶、红色比卡维林）的酿酒酵母菌株的影响。研究将比卡维林合成基因整合至单倍体 S288C 背景菌株，将靛蓝啶合成基因整合至单倍体与二倍体 CEN.PK 背景菌株的相同基因位点；分别在以呼吸型碳源半乳糖为唯一碳源的丰富培养基与合成限定培养基中，通过连续分批传代开展约 200 代与 175 代的适应性进化。
结果显示，无论培养基类型与菌株倍性如何，靛蓝啶色素表型均快速丢失，而比卡维林色素表型具有高度稳定性；半乳糖利用能力缺陷的 S288C 背景比卡维林生产菌株的适应性进化解决方案集中在半乳糖利用通路的突变，而靛蓝啶生产菌株则在异源合成通路中反复出现突变。当比卡维林生产菌株在偏好碳源葡萄糖中进行适应性进化时，也检测到了色素表型丢失的克隆。综上，工程化性状的进化稳定性取决于生产环境的选择压力，以及适应性解决方案的可获得性与适配度带来的细胞适应性收益。
关键词
适应性实验室进化、酿酒酵母、异源合成途径、进化稳定性、靛蓝啶、比卡维林、达尔文选择
研究目的
系统探究达尔文自然选择对工程化酿酒酵母异源合成途径稳定性的影响，明确异源生产性状在传代过程中丢失的核心规律。
对比两种不同异源合成途径（靛蓝啶、比卡维林）在不同遗传背景、倍性、培养基与碳源环境下的进化稳定性差异。
解析工程菌株适应性进化的基因突变靶点，明确环境选择压力与细胞适应性收益对工程性状稳定性的调控机制。
为提升工业微生物工程化生产性状的长期遗传稳定性提供理论依据与实验支撑。
研究思路
菌株构建：将靛蓝啶、比卡维林两种异源色素合成途径分别整合至酿酒酵母 CEN.PK（单倍体 / 二倍体）与 S288C 背景菌株的相同基因组位点，构建出发菌株。
适应性实验室进化（ALE）：对所有菌株设置 4 个平行进化谱系，分别在半乳糖为唯一碳源的丰富 / 合成培养基、葡萄糖为唯一碳源的丰富 / 合成培养基中连续传代 25 次，完成 175~200 代的适应性进化，实验流程见 Fig.1。
表型追踪：在进化过程中定期对菌株进行平板涂布，统计色素阳性菌落占比，追踪工程性状的稳定性。
生长表型表征：对出发菌株与进化终点菌株进行生长曲线测定，分析最大比生长速率、延滞期等生长参数的变化。
基因型解析：对出发菌株与进化终点菌株进行全基因组测序，鉴定富集的突变位点，解析适应性进化的分子机制。
机制验证：对筛选到的关键突变位点进行反向工程验证，确认其对细胞适应性的影响。
数据整合：结合表型与基因型数据，明确环境选择压力、细胞适应性收益与工程性状进化稳定性的关联规律。
研究亮点
首次系统对比了两种不同前体来源的异源合成途径（谷氨酰胺来源的靛蓝啶、乙酰辅酶 A 来源的比卡维林）在酿酒酵母中的进化稳定性，揭示了异源途径本身与环境选择压力共同决定工程性状遗传稳定性的核心规律。
发现了 “环境适应性收益可替代工程性状丢失带来的收益” 这一关键机制 —— 当菌株面临非偏好碳源（半乳糖）的强环境选择压力时，适应性突变集中在碳源利用通路，异源生产性状可保持高度稳定；而在偏好碳源（葡萄糖）的弱选择压力下，工程性状更易发生丢失。
明确了菌株倍性、培养基营养水平对异源途径进化稳定性的影响，证实靛蓝啶性状的丢失与菌株倍性、培养基类型无关，为工业菌株倍性选择与培养基优化提供了参考。
结合全基因组测序与反向工程验证，精准定位了半乳糖利用通路 GAL2 基因的关键突变，量化了其对 S288C 菌株半乳糖利用能力的提升效果，为酵母碳源利用改造提供了新靶点。
创新性地以色素为可视化报告元件，实现了对工程性状稳定性的高通量、可视化追踪，为微生物进化稳定性研究提供了便捷的实验模型。
可延伸的研究方向
基于本研究发现的规律，构建生长 - 产物偶联的基因回路，将异源产物合成与菌株碳源利用、核心生长代谢绑定，进一步提升工程性状的进化稳定性。
探究异源途径的基因组整合位点、拷贝数、启动子强度对进化稳定性的影响，优化途径表达策略以降低工程菌的代谢负担与性状丢失风险。
对本研究中筛选到的稳定生产比卡维林的进化菌株进行多组学分析，解析其代谢流重编程机制，进一步提升目标产物的合成效率。
拓展研究至其他工业常用异源合成途径（如萜类、聚酮类、大宗化学品合成途径），验证本研究发现的进化稳定性规律的普适性。
结合基因编辑技术构建突变率可控的工程菌株，在菌株扩培阶段降低突变率，减少非生产克隆的富集，适配工业放大生产的需求。
探究连续发酵、补料分批发酵等不同工业发酵模式对工程性状进化稳定性的影响，为工业生产过程优化提供依据。
测量数据及研究意义（标注原文对应图表）
菌株生长曲线与最大比生长速率数据：测定了出发菌株与进化终点菌株在不同培养基中的生长动态、最大比生长速率、延滞期长度，其中靛蓝啶生产菌株的相关数据来自 Fig.2，比卡维林生产菌株半乳糖培养基中的生长数据来自 Fig.3，葡萄糖培养基中的生长数据来自 Fig.8。研究意义：量化了异源途径表达对菌株生长的代谢负担，证实适应性进化可显著提升 S288C 菌株在半乳糖中的生长能力，明确了不同进化环境下菌株生长表型的变化规律，为适应性收益的评估提供了核心数据支撑。
菌株细胞死亡率数据：测定了靛蓝啶生产出发菌株与进化终点菌株的细胞死亡比例，数据来自 Fig.4。研究意义：证实靛蓝啶的合成会造成菌株细胞活力下降，而适应性进化可显著提升菌株的细胞存活率，明确了靛蓝啶生产菌株的进化方向除了途径失活，还包括细胞活力的提升，补充了菌株适应性表型的评估维度。
色素阳性菌落占比的动态变化数据：在进化传代过程中定期统计了色素阳性菌落的比例，其中靛蓝啶菌株的数据来自 Fig.5、Fig.6a-b，比卡维林菌株半乳糖培养基数据来自 Fig.6c-d、Fig.7，葡萄糖培养基数据来自 Fig.8c-d。研究意义：直观可视化地追踪了两种异源生产性状在进化过程中的稳定性差异，明确了靛蓝啶性状快速丢失、比卡维林性状在半乳糖中高度稳定的核心表型，是本研究核心结论的关键支撑数据。
色素产量定量数据：通过分光光度法与 HPLC 分别测定了出发菌株与进化终点菌株的靛蓝啶、比卡维林产量，数据来自补充材料 Fig.S2、Fig.S3。研究意义：从定量层面验证了平板菌落计数的表型结果，证实进化后靛蓝啶菌株完全丧失产物合成能力，而半乳糖中进化的比卡维林菌株单位生物量产量反而提升，进一步完善了工程性状稳定性的评估。
全基因组测序的突变位点数据：对出发菌株与进化终点菌株进行全基因组测序，鉴定了富集的单核苷酸变异、插入缺失突变，数据来自补充材料 Table S8、Table S9。研究意义：从基因型层面解析了菌株适应性进化的分子机制，证实靛蓝啶菌株的突变集中在异源途径的 bpsA 基因，而比卡维林菌株的突变集中在半乳糖利用通路，为表型差异提供了直接的分子证据。
GAL2 突变体的反向工程验证数据：将进化中筛选到的 GAL2 突变重新整合至野生型 S288C 菌株，测定了其最大比生长速率，数据来自补充材料 Table S10。研究意义：直接验证了 GAL2 突变对菌株半乳糖利用能力的提升效果，证实该突变是 S288C 菌株在半乳糖中适应性进化的核心靶点，明确了环境适应性突变的生物学功能。
核心结论
工程化酿酒酵母的异源合成性状会受到达尔文选择的强烈影响，异源途径的表达会造成菌株代谢负担与生长劣势，导致生产性状在传代过程中存在固有丢失风险。
两种异源色素合成途径的进化稳定性存在显著差异：靛蓝啶合成性状无论在何种培养基、菌株倍性下均快速丢失，其进化过程中反复出现异源途径关键基因 bpsA 的失活突变；而比卡维林合成性状在半乳糖为唯一碳源的环境中具有高度稳定性，进化过程中未出现异源途径的高频失活突变。
工程性状的进化稳定性核心取决于环境选择压力与适应性解决方案的收益：当菌株面临非偏好碳源（半乳糖）的强选择压力时，碳源利用通路的突变可带来巨大的生长收益，替代了异源途径失活带来的收益，从而保护了工程性状的稳定性；而在偏好碳源（葡萄糖）的弱选择压力下，环境适应性收益有限，异源途径失活带来的生长收益成为主导，生产性状更易发生丢失。
菌株倍性、培养基营养水平未改变靛蓝啶性状快速丢失的整体趋势，仅影响了性状丢失的速率。
适应性进化不仅可提升菌株的环境适应能力，在不丢失生产性状的前提下，还可优化菌株的代谢效率，实现单位生物量目标产物产量的提升。
芬兰 Bioscreen 仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
高通量、高重复性的生长表型精准量化。本研究使用芬兰 Bioscreen FP-1100-C 仪器，实现了对出发菌株与进化终点菌株共数十个样本、每个样本 10 个生物学重复的生长曲线同步监测，每 30 分钟采集一次 OD600 数据，高效获得了海量、高重复性的生长动态数据，解决了传统摇瓶培养与分光光度计手动测定通量低、误差大、时间分辨率不足的问题。
核心生长参数的标准化提取与统计验证。基于 Bioscreen 采集的生长曲线数据，研究通过标准化公式校正了光程长度与高细胞密度下的非线性误差，精准提取了菌株的最大比生长速率、延滞期长度等关键生理参数，并通过 ANOVA 与 Tukey's 检验完成了统计学显著性分析。这些参数是评估异源途径代谢负担、适应性进化对菌株生长能力提升效果的核心指标，为整个研究的表型分析奠定了数据基础。
异源途径代谢负担的直观量化。通过 Bioscreen 的生长数据，直接证实了异源色素合成途径的表达会显著降低酿酒酵母的最大比生长速率、延长延滞期，精准量化了靛蓝啶、比卡维林两种异源途径对宿主细胞的代谢负担差异，为后续进化过程中生长表型的变化提供了基线对照。
适应性进化效果的高效批量评估。基于 Bioscreen 的生长曲线数据，快速明确了 S288C 背景菌株在半乳糖培养基中经过适应性进化后，最大比生长速率提升 1.6~1.7 倍、延滞期缩短近一半，而 CEN.PK 背景菌株的生长提升幅度相对有限，高效完成了不同菌株、不同进化环境下适应性进化效果的批量评估，锁定了 S288C 菌株在半乳糖中的强适应性选择压力。
实验条件的精准可控与结果可重复性保障。Bioscreen 仪器实现了培养温度、振荡模式与转速的全程精准控制，消除了传统培养方式中环境波动带来的实验误差，确保了生长数据的稳定性与可重复性，为不同菌株、不同批次实验结果的横向对比提供了统一的标准，保障了研究结论的可靠性。
为后续分子机制研究提供明确方向。Bioscreen 的生长数据明确了 S288C 菌株在半乳糖中的生长缺陷是其核心选择压力，引导研究人员聚焦半乳糖利用通路的基因突变分析，最终精准定位了 GAL2 基因的关键适应性突变，为全基因组测序的突变靶点解析与功能验证提供了明确的表型指引。