Metabolomic analysis of cooperative adaptation between Co-cultured Lacticaseibacillus casei Zhang and Lactiplantibacillus plantarum P8
共培养干酪乳杆菌 Zhang 与植物乳杆菌 P8 协同适应性的代谢组学分析
来源：LWT - Food Science and Technology 170 (2022) 114105
1. 论文摘要
微生物次级代谢产物因其丰富的化学多样性和广泛的生物活性，一直被视为天然活性分子的潜在来源。越来越多的证据表明，益生菌菌株共培养具有协同效应，可促进生物活性分子的生成，产出稳定性和 / 或功能特性更优的次级代谢产物。本研究采用非靶向代谢组学方法，探究了干酪乳杆菌 Zhang（LcZ）与植物乳杆菌 P8（P8）在共培养过程中的互作关系。结果显示，LcZ 与 P8 共培养组（LcZ+P8）相较于单菌培养表现出更强的生长能力；多元统计分析发现，不同菌株间、同一菌株不同生长阶段的代谢谱均存在显著差异；此外，菌株生长过程中菌体细胞与培养基代谢物的变化，与能量产生过程密切相关。更重要的是，在共培养体系中鉴定出了多种新型生物活性物质，以及表达水平上调、对人体健康具有潜在益处的代谢物。本研究是首次系统鉴定 P8 与 LcZ 构建的微生态系统中代谢物层面共生互作关系的研究，研究结果为菌株间系统水平的协同适应机制提供了全新见解，也为微生物天然产物的进一步开发提供了理论支撑。
2. 论文关键词
共培养、非靶向代谢组学、微生物互作、代谢潜力、益生潜力
3. 研究目的
① 基于非靶向代谢组学技术，系统探究干酪乳杆菌 Zhang 与植物乳杆菌 P8 在共培养过程中的菌株互作规律，从代谢物交换的角度深度解析微生物种间信号交流的外源分子作用，从分子层面阐明共培养过程中微生物的代谢调控机制。
② 分析共培养对两株菌生长特性、胞内与胞外代谢谱的影响，明确不同生长阶段差异代谢物的种类、变化规律与生物学功能，挖掘共培养诱导产生的新型生物活性次级代谢产物。
③ 验证益生菌共培养策略在激活菌株沉默代谢通路、提升益生代谢物产量方面的价值，为生物医药领域先导化合物发现、食品工业功能性食品开发提供更多天然活性分子，推动微生物天然产物的开发与应用。
4. 研究思路
① 菌株培养与样品采集：将 LcZ 和 P8 分别进行单菌培养，同时按 1:1 接种比例进行共培养，采用芬兰 Bioscreen C 系统实时监测菌株生长曲线，根据生长周期特征，分别在 2h（延滞期末）、6h（对数期中期）、10h（稳定期初期）、24h（稳定期中期）采集菌体细胞沉淀与无细胞发酵上清液（CFS），以 0h 新鲜 MRS 培养基作为空白对照。
② 非靶向代谢组学检测：采用超高效液相色谱 - 四极杆飞行时间质谱联用系统（UPLC-Q-TOF-MS），对菌体细胞和 CFS 样品进行代谢组学检测，优化色谱与质谱检测条件，同时制备混合质控样品（QC），全程监测仪器稳定性与检测系统性能。③ 数据预处理与统计分析：使用 Progenesis QI 软件对原始质谱数据进行峰提取、峰对齐、去卷积与保留时间校正，经分位数归一化和对数转换后，导入 MetaboAnalyst 5.0 进行多元统计分析；通过主成分分析（PCA）可视化代谢谱整体差异，采用偏最小二乘判别分析（PLS-DA），以变量重要性投影 VIP>1、错误发现率 FDR 校正后 P<0.05 为阈值筛选关键差异代谢物。④ 差异代谢物鉴定与功能分析：通过比对 ChemSpider、METLIN 数据库，结合精确质量数、保留时间、同位素分布与 MS/MS 碎片信息，完成差异代谢物的结构鉴定；分析不同培养方式、不同生长阶段的代谢物分布规律与表达变化趋势，解析关键差异代谢物的益生功能与生物学意义。
⑤ 互作机制解析与结论总结：整合菌株生长特性、代谢谱差异、关键代谢物功能等多维度数据，阐明 LcZ 与 P8 共培养过程中的协同适应机制与种间互作规律，总结共培养策略在微生物天然产物开发中的应用价值，最终得出研究结论。
5. 研究亮点
① 首次系统解析了内蒙古来源的两株特色益生菌 —— 干酪乳杆菌 Zhang 与植物乳杆菌 P8 共培养过程中的代谢层面共生互作机制，填补了这两株商用益生菌共培养互作的研究空白，为乳酸菌种间互作研究提供了新的模型。
② 证实了两株菌共培养具有显著的生长协同效应，共培养组在全生长周期均表现出更高的生长速率，同时明确了干酪乳杆菌 Zhang 在共培养体系的代谢谱形成中发挥主导作用，为复合益生菌发酵剂的开发与优化提供了直接的理论依据。③ 发现共培养策略可显著拓展益生菌的代谢多样性：不仅使 3,4 - 二羟基氢化肉桂酸、肉桂酸、L - 乙酰肉碱、琥珀酸、核黄素等多种具有抗氧化、抗菌、神经保护、免疫调节功能的益生代谢物实现高表达，还诱导产生了芒果苷、磷脂酰肌醇等单菌培养中未检测到的新型生物活性代谢物，拓展了益生菌代谢产物的开发边界。
④ 揭示了乳酸菌共培养中代谢物变化与菌株生长阶段的强关联规律，证实了菌株间的代谢物交换可激活单菌培养中沉默的代谢通路，为通过共培养策略挖掘微生物沉默基因、开发新型微生物天然活性产物提供了方法学参考。
6. 可延伸的研究方向
① 多组学联合解析分子调控机制：结合转录组、蛋白质组与靶向代谢组学，深入解析 LcZ 与 P8 共培养协同互作的分子调控网络，明确关键代谢通路的基因表达、蛋白合成与代谢物变化的关联，揭示菌株互作的深层分子机制。
② 新型代谢物的分离纯化与功能验证：对共培养特有的芒果苷、磷脂酰肌醇，以及未鉴定的新型差异代谢物进行分离纯化，通过体内外实验系统验证其生物活性与益生功能，挖掘其在食品、医药、化妆品领域的应用潜力。③ 共培养发酵工艺的工业化优化：优化两株菌的接种比例、发酵温度、培养基组成、补料策略、发酵周期等工艺参数，最大化目标益生代谢物的产量，开发可规模化应用的复合益生菌发酵工艺。④ 共培养体系的实际应用效果验证：在发酵乳、植物基发酵食品等真实食品体系中，验证该共培养体系对产品风味、质构、营养功能的影响；同时通过动物实验验证共培养发酵产物的体内益生功能，为功能性发酵食品的开发提供完整的数据支撑。⑤ 菌株间营养交叉喂养机制解析：深入研究两株菌在共培养过程中氨基酸、维生素、碳水化合物等营养物质的交叉互补机制，明确乳酸菌共培养协同生长的核心营养代谢基础，为精准设计益生菌共培养体系提供理论支撑。
⑥ 拓展共培养菌株组合与应用场景：基于本研究的共培养策略，拓展更多益生菌、工业微生物的菌株组合共培养，挖掘更多新型生物活性代谢物；同时探索该共培养体系在青贮饲料、食品生物防腐、生物医药等领域的应用价值。
7. 测量数据、对应图表及研究意义
① 菌株全周期生长曲线数据
数据内容：测定了 P8 单培养、LcZ 单培养、LcZ+P8 共培养在 37℃ MRS 培养基中的全生长周期 OD600 变化，明确了菌株延滞期、对数期、稳定期的关键节点，以及不同培养方式下的生长速率差异。
数据来源：Fig 1. Growth curves of P8, LcZ and LcZ + P8 cultured in MRS broth medium at 37 ℃(A)
研究意义：① 直接证实了 LcZ 与 P8 共培养具有显著的生长协同效应，共培养组在各个生长阶段均表现出最高的生长速率，为菌株间存在正向互作提供了最直观的表型证据；② 精准确定了 2h、6h、10h、24h 四个代表性采样时间点，确保代谢组学样品能完整覆盖菌株生长的关键阶段，为后续实验设计奠定了核心基础。
② 不同培养方式、不同生长阶段的差异代谢物数量统计数据
数据内容：统计了相同生长阶段下，P8 单培养、LcZ 单培养、LcZ+P8 共培养的菌体细胞与 CFS 中的差异代谢物数量，以及随培养时间的变化趋势。
数据来源：Fig 1(B) The number of differential metabolites identified in the P8 and LcZ monocultures, and LcZ + P8 co-culture, at the same growth stage.
研究意义：① 明确了随培养时间延长，菌体细胞与 CFS 中的差异代谢物数量均显著增加，反映了菌株在不同生长阶段的生理状态与代谢特性存在显著差异；② 发现菌体胞内差异代谢物数量远高于 CFS，说明菌株间互作首先引发了胞内代谢网络的显著重构；③ 证实共培养可显著提升胞内差异代谢物的丰富度，为挖掘共培养诱导的新型代谢物提供了数据支撑。
③ 菌体细胞与 CFS 代谢谱的 PCA 多元统计分析数据
数据内容：通过主成分分析 PCA，可视化了三种培养方式的菌体细胞代谢物、CFS 代谢物的整体差异，以及质控样品的分布情况。
数据来源：Fig 1(C) PCA plots of the cell metabolites; Fig 1(D) PCA plots of the CFS metabolites.
研究意义：① 直观证实了不同菌株、不同培养方式的代谢谱存在本质差异，说明共培养显著改变了菌株的代谢结构与组成；② 发现共培养组的代谢谱分布于两株单菌之间，且与 LcZ 的代谢谱更接近，从代谢组学层面证实了 LcZ 在共培养体系中发挥主导作用，与生长曲线结果形成相互印证；③ 质控样品紧密聚集于三组中间，验证了代谢组学检测实验的稳定性与可重复性，确保了后续数据的可靠性。
④ 同一菌株不同生长阶段的代谢谱 PCA 分析数据
数据内容：对三种培养方式的菌株，在不同生长阶段的菌体细胞与 CFS 代谢物进行 PCA 分析，明确了同一菌株随培养时间的代谢谱分离情况。
数据来源：Fig S1
研究意义：① 证实了三种培养方式的菌株，其代谢物均随培养时间点呈现显著分离，说明菌株在不同生长阶段的生理状态与代谢特性存在明显差异；② 明确了菌株间的代谢差异主要沿主成分 1（PC1）分布，而培养时间带来的代谢差异沿 PC2 分布，为后续分阶段分析差异代谢物提供了统计学依据。
⑤ 相同生长阶段不同培养方式的代谢谱 PCA 分析数据
数据内容：对同一生长时间点下，三种培养方式的菌体细胞与 CFS 代谢物进行 PCA 分析，明确了相同时点不同培养方式的代谢谱差异。
数据来源：Fig S2
研究意义：① 证实了从培养初期开始，三种培养方式的菌体细胞代谢谱就存在显著分离，且随培养时间延长始终保持差异，说明单菌与共培养的代谢特性从生长初期就存在本质区别；② 发现培养初期 CFS 代谢谱与空白培养基无显著差异，随培养时间延长出现明显分离，且发酵后期共培养组的 CFS 代谢谱与 LcZ 单培养几乎重合，进一步证实了 LcZ 在共培养胞外代谢物中占据主导地位。
⑥ 相同生长阶段关键差异代谢物的分布与交集数据
数据内容：通过 UpSet 图展示了 2h、6h、10h、24h 四个时间点，三种培养方式的菌体细胞与 CFS 中关键差异代谢物（VIP>1，FDR 校正 P<0.05）的数量、分布与交集情况。
数据来源：Fig 2. Distribution of key differential metabolites among P8, LcZ and LcZ + P8 at the same growth stage. A–D represent the distribution of the cell metabolic profiles at 2, 6, 10 and 24 h, respectively; a–d represent the distribution of the CFS metabolic profiles at 0, 2, 6, 10 and 24 h, respectively.
研究意义：① 明确了共培养组在各个生长阶段的胞内关键差异代谢物数量均显著高于单菌，且单菌中检测到的代谢物在共培养中均能检出，同时共培养存在单菌未检测到的特有代谢物，证实了共培养可激活菌株的沉默代谢通路，拓展代谢多样性；② 发现 CFS 中关键差异代谢物数量随培养时间显著增加，且共培养组的 CFS 差异代谢物数量低于单菌，揭示了共培养过程中菌株间存在营养竞争，部分胞外代谢物被菌株作为营养物质再利用；③ 进一步证实了共培养组的胞内代谢物与 LcZ 更相似，再次印证了 LcZ 的主导作用。
⑦ 共培养组关键差异代谢物的鉴定与表达变化数据
数据内容：在共培养组的 CFS 中鉴定出 45 种随生长时间显著变化的关键差异代谢物，主要包括糖类、有机酸、氨基酸及其衍生物、小分子肽、维生素、核苷酸及其衍生物；在菌体细胞中鉴定出 56 种关键差异代谢物，其中 4 种为共培养组特有；通过热图展示了这些代谢物在不同生长阶段的表达水平变化。
数据来源：Fig 3. Identification of the key differential metabolites of LcZ + P8 among the three cultures during growth. Heat map (A) shows the distribution of the CFS metabolites; Heat map (B) and UpSet plot (C) show the distribution of the cell metabolites.、Table S1
研究意义：① 系统鉴定了共培养过程中的关键差异代谢物，明确了其随生长周期的变化规律，发现大部分基础营养代谢物随菌株生长被消耗，而具有益生功能的代谢物随培养时间持续高表达，为解析共培养的益生潜力提供了物质基础；② 发现共培养特有的芒果苷具有抗病毒、抗癌、抗氧化、免疫调节等多种生物活性，磷脂酰肌醇参与细胞形态维持、代谢调控与信号转导，证实了共培养可产生高附加值的新型生物活性代谢物；③ 发现共培养组中 TCA 循环相关的柠檬酸、琥珀酸、琥珀酰辅酶 A 等物质高表达，揭示了菌株间协同互作可增强能量代谢，这是共培养菌株生长能力更强的核心代谢基础。
⑧ 共培养微生物互作机制的通路示意图
数据内容：绘制了共培养微生物互作机制示意图，展示了两株菌通过代谢物交换激活沉默基因、产生新型代谢物的过程，以及新型代谢物的潜在生物活性。
数据来源：Fig 4. Schematic of the co-cultured microorganisms and associated mechanism, which should aid the discovery of novel bioactive secondary metabolites.
研究意义：直观、系统地总结了乳酸菌共培养激活沉默代谢通路、产生新型生物活性次级代谢物的核心机制，为该领域后续研究提供了清晰的理论框架，同时展示了共培养策略在天然活性产物开发中的应用价值。
8. 核心研究结论
① 非靶向代谢组学结合多元统计分析，是研究乳酸菌菌株间互作的有效方法；LcZ 与 P8 的种间互作，显著改变了菌株次级代谢产物的数量与表达水平，使菌株的整体代谢谱发生了显著变化。
② LcZ 与 P8 在共培养过程中表现出显著的生长协同效应，共培养组在全生长周期的生长能力均强于单菌培养；同时在共培养体系中，LcZ 对菌株整体代谢谱的形成发挥主导作用。③ 两株菌的共培养不仅使 3,4 - 二羟基氢化肉桂酸、肉桂酸、L - 乙酰肉碱、琥珀酸、核黄素等多种对人体有益的代谢物实现高表达，还诱导产生了芒果苷、磷脂酰肌醇等单菌培养中未检测到的、具有多样生物活性的新型次级代谢物。
④ 本研究首次系统鉴定了 LcZ 与 P8 构建的微生态系统中代谢物层面的共生互作关系，揭示了两株菌间的协同适应机制；该共培养策略可为生物医药领域先导化合物发现、食品工业功能性食品开发提供更多天然活性分子，推动微生物天然产物的进一步开发。
9. 芬兰 Bioscreen 仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究采用芬兰 Bioscreen C 系统（Growth curves AB Ltd., Helsinki, Finland），全自动测定了 P8 单培养、LcZ 单培养、LcZ+P8 共培养在 MRS 培养基中 37℃下的 OD600 值，绘制了菌株全周期生长曲线。该数据是整个研究的基础与前提，其核心研究意义分为以下 7 个层面：
① 为整个研究的实验设计提供了核心的生长周期依据，确定了代谢组学样品的关键采样时间点
微生物的代谢谱随生长阶段发生动态、显著的变化，精准的生长阶段划分是代谢组学分析结果可靠性的核心前提。芬兰 Bioscreen C 系统通过全自动、高频次的 OD600 实时检测，获得了三组菌株完整的生长动力学曲线，精准明确了 2h 为延滞期末、6h 为对数期中期、10h 为稳定期初期、24h 为稳定期中期的生长周期特征。基于该数据，研究确定了这 4 个代表性时间点进行菌体和发酵上清的样品采集，确保了采集的样品能完整覆盖菌株从生长初期到稳定期的全代谢变化过程，避免了因采样时间点偏离关键生长阶段导致的代谢组学数据偏差，为后续非靶向代谢组学分析的科学性和准确性奠定了核心基础。
② 直接证实了 LcZ 与 P8 共培养的生长协同效应，明确了菌株间的正向互作关系
Bioscreen 系统获得的生长曲线数据直观显示，LcZ+P8 共培养组在各个生长阶段均表现出最高的生长速率，显著优于两株单菌培养；发酵初期 P8 生长速率快于 LcZ，而对数期后 LcZ 生长速率反超，共培养组的生长曲线与 LcZ 趋于一致。该数据直接证实了两株菌在共培养过程中存在显著的正向互作与协同生长效应，菌株间的代谢物交换与营养互补促进了彼此的生长繁殖，为后续探究菌株间的共生互作机制提供了最直接的表型证据，也为复合益生菌发酵剂的开发提供了核心的生长特性数据支撑。
③ 排除了生长速率差异对代谢组学数据的干扰，确保了代谢谱差异的因果性
代谢组学分析中，菌株生长速率的差异会直接导致胞内与胞外代谢物水平的系统性变化。若无法区分代谢谱差异是由菌株间互作直接导致，还是由生长能力不同间接引起，会使整个研究的核心结论失去可靠性。芬兰 Bioscreen 系统获得的高精度生长曲线数据，精准量化了不同菌株在各个生长阶段的生长状态，研究基于该数据选择了相同生长阶段的样品进行代谢组学比对分析，彻底排除了因菌株生长周期不同步、生长速率差异带来的代谢物水平干扰，确保了检测到的代谢谱差异是由 LcZ 与 P8 的共培养互作直接导致，而非生长能力的间接影响，保障了整个研究核心结论的因果性与科学性。
④ 提供了高精度、高重复性的生长动力学定量数据，保障了实验的可重复性
传统的手动分光光度计法测定生长曲线，存在取样操作误差、培养环境温度波动、检测时间间隔长、批次间差异大等问题，难以获得精准、可重复的生长动力学数据。而芬兰 Bioscreen C 系统具备恒温密闭培养、持续震荡、多通道全自动同步检测的特性，实现了 P8 单培养、LcZ 单培养、LcZ+P8 共培养组在完全一致的培养环境中同步生长与检测，大幅降低了人为操作与环境因素带来的系统误差，获得的生长曲线数据具有极高的重复性与精确度。该数据不仅为本次研究提供了可靠的生长特性依据，也为后续该两株菌的共培养发酵研究提供了可重复、可参考的生长动力学基础数据。
⑤ 验证了共培养体系中 LcZ 的主导地位，与代谢组学结果形成了相互印证
Bioscreen 系统的生长曲线数据显示，对数期后 LcZ 的生长速率显著快于 P8，且共培养组的生长曲线与 LcZ 单培养高度一致。该表型数据与后续 PCA 代谢组学分析结果（共培养组的代谢谱分布于两株单菌之间，且与 LcZ 的代谢谱更接近，发酵后期共培养组的 CFS 代谢谱与 LcZ 几乎重合）形成了完美的相互印证，从生长表型和代谢组学两个层面，共同证实了 LcZ 在 LcZ+P8 共培养体系中占据主导地位，为解析两株菌的互作模式提供了关键的表型与组学双重证据。
⑥ 为后续共培养发酵工艺的优化提供了基础的生长动力学参数
Bioscreen 系统获得的生长曲线数据，明确了 LcZ 与 P8 单培养和共培养的延滞期时长、对数期比生长速率、稳定期的最大生物量、进入稳定期的时间等关键发酵动力学参数。这些参数是后续优化两株菌共培养发酵工艺的核心基础，包括接种比例、接种量、发酵温度、发酵时间、补料策略等关键工艺参数的优化，均需要以该生长动力学数据为依据，为该共培养体系从实验室研究向工业化发酵应用转化提供了关键的基础数据支撑。
⑦ 建立了乳酸菌共培养生长特性的标准化评价方法，为同类研究提供了方法学参考本研究基于芬兰 Bioscreen C 系统建立的乳酸菌单培养与共培养生长曲线测定方法，具备高通量、自动化、高重复性、低系统误差的特点，可同时完成多组样品的同步生长监测，适用于乳酸菌复合培养体系的生长特性评价。该方法为后续其他乳酸菌菌株组合的共培养互作研究、复合益生菌发酵剂的生长特性评价等同类研究，提供了标准化、可推广的方法学参考，有助于提升乳酸菌共培养研究中生长特性数据的准确性与可比性。