Potent eradication of mixed-species biofilms using photodynamic inactivation coupled with slightly alkaline electrolyzed water
光动力灭活联合弱碱性电解水高效清除混合菌种生物被膜
来源：LWT - Food Science and Technology 155 (2022) 112958
1. 论文摘要
本研究首创了以弱碱性电解水（SAlEW）为光敏剂溶剂的光动力灭活（PDI）新型抗生物被膜技术，并通过监测副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌混合生物被膜的生物量、细胞活性、再生长能力及空间结构，验证了该技术的清除效力。同时通过检测活性氧（ROS）产量、光敏剂叶绿素铜钠盐（SCC）的理化性质，阐明了其作用机制。结果表明，SAlEW 大幅提升了 SCC 的渗透性、稳定性与 ROS 生成能力，可强效破坏生物被膜胞外聚合物（EPS）的核心化学成分，进而瓦解生物被膜的空间结构。在 150 μM SCC、4.56 J/cm² 光照的条件下，PDI 联合 SAlEW 可使混合生物被膜的生物量降低 72.4%、活菌数减少 3.51 Log CFU/mL、细胞活性下降 85.7%。值得注意的是，该技术可高效清除鱼鳞与不锈钢表面的混合生物被膜，细胞活性分别降低 86% 和 70% 以上。因此，PDI 联合 SAlEW 是食品工业中防控生物被膜污染的极具潜力的新策略。
2. 论文关键词
光动力灭活、弱碱性电解水、混合菌种生物被膜、胞外聚合物
3. 研究目的
① 针对副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌混合生物被膜存在协同互作、对抗菌手段抗性显著增强，而传统 PDI 技术对其清除效率低的行业痛点，首创 PDI 联合 SAlEW 的新型抗生物被膜技术，实现对混合菌种生物被膜的高效清除。
② 系统阐明 SAlEW 增强 PDI 杀菌效率的内在作用机制，明确其对光敏剂 SCC 理化性质、ROS 生成、生物被膜 EPS 结构与组分的影响，为技术优化提供理论支撑。③ 验证该联合技术在食品工业真实场景（不锈钢食品接触面、水产品鱼鳞表面）中对混合生物被膜的清除效果，开发一种安全、高效、绿色的非热杀菌新技术，为食品工业生物被膜污染防控提供解决方案。
④ 选用食品级天然光敏剂 SCC 与可饮用级 SAlEW，构建完全适配食品工业安全要求的杀菌体系，解决传统光敏剂毒性、化学消毒剂残留的食品安全问题。
4. 研究思路
① 菌株培养与混合生物被膜构建：以食源性致病菌副溶血性弧菌 ATCC 17802、水产品腐败菌腐败希瓦氏菌 05 为研究对象，将两种菌等量混合后在 25℃下培养 18 h，形成成熟的混合菌种生物被膜。
② PDI-SAlEW 联合技术体系构建：以食品级 SCC 为光敏剂，SAlEW 为溶剂溶解 SCC，以 455~460 nm 蓝光 LED 为光源，设置不同 SCC 浓度梯度（20~200 μM）与光照能量梯度（1.14~6.84 J/cm²），同时设置空白对照、单独 PDI、单独 SAlEW 三组对照，开展处理实验。③ 联合技术的生物被膜清除效率多维度验证：通过结晶紫（CV）法测定生物被膜生物量，平板计数法检测活菌数变化，MTT 法评估细胞代谢活性；利用芬兰 Bioscreen C MBR 全自动生长曲线仪测定处理后生物被膜细胞 36 h 内的再生长能力，通过 Baranyi 模型拟合生长动力学参数；借助共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）、原子力显微镜（AFM）从微观层面观察生物被膜三维空间结构、表面形貌的变化。④ 联合技术的增效机制系统解析：通过 ABDA 荧光探针检测体系中单线态氧（¹O₂）的产量，明确 ROS 生成的变化；测定不同体系的表面张力、SCC 的紫外 - 可见吸收光谱，分析 SAlEW 对 SCC 渗透性、光化学稳定性的影响；定量检测生物被膜 EPS 中胞外多糖、胞外蛋白、eDNA 的含量变化，阐明联合技术对生物被膜核心屏障的破坏机制。⑤ 实际应用场景的效果验证：在食品工业常见的不锈钢（食品接触表面）、鱼鳞（水产品基质表面）上构建混合生物被膜，通过 CV 法、平板计数、MTT 法、扫描电子显微镜（SEM），系统验证 PDI 联合 SAlEW 对实际接触面生物被膜的清除效果。
⑥ 数据统计与结论总结：通过单因素方差分析（ANOVA）与 Duncan 多重极差检验完成数据的统计学分析，整合宏观杀菌效果、微观结构变化、作用机制、实际应用验证的全流程实验结果，总结联合技术的优势、应用价值与工业化潜力。
5. 研究亮点
① 首创了以可饮用级 SAlEW 为光敏剂溶剂的 PDI 杀菌新技术，首次实现 PDI 与 SAlEW 的协同联用，解决了传统 PDI 对协同抗性混合生物被膜清除效率低的核心痛点，最优条件下可使混合生物被膜活菌数减少 3.51 Log CFU/mL，清除效果远优于单独 PDI 与单独 SAlEW 的加和。
② 阐明了 SAlEW 增强 PDI 效率的三重核心机制：一是降低溶液表面张力，提升 SCC 的润湿性、铺展性与渗透性，利于光敏剂穿透 EPS 屏障；二是提升 SCC 的光化学稳定性，光照下光敏剂降解率从 14.0% 降至 2.5%，保障其持续产生活性氧；三是显著提升光照下 ¹O₂的产量，增强对生物被膜与细菌的氧化破坏能力。③ 构建了食品级安全的杀菌体系，选用天然叶绿素衍生物 SCC 作为光敏剂，溶剂为多国批准的可饮用级 SAlEW，无有毒化学试剂残留，完全适配食品工业的安全生产要求，突破了传统光敏剂毒性、化学消毒剂残留的应用限制。④ 从宏观到微观多维度完成了技术效果验证，不仅定量测定了生物量、活菌数、细胞活性等宏观杀菌指标，还通过 CLSM、AFM、SEM 直观证实了联合技术对生物被膜三维结构的瓦解、对细菌细胞形态的破坏，实现了从宏观杀菌效果到微观作用机制的完整闭环验证。
⑤ 完成了食品工业真实场景的应用验证，证实该技术对不锈钢食品接触面、水产品鱼鳞表面的混合生物被膜均具备高效清除能力，细胞活性分别降低 87% 和 86%，为食品加工设备消毒、水产品保鲜与安全防控提供了新型非热杀菌解决方案。
6. 可延伸的方向
① 技术体系的优化升级：筛选更适配 SAlEW 体系的天然食品级光敏剂，优化光敏剂浓度、光照参数、SAlEW 的 pH 与氧化还原电位（ORP）等核心参数，进一步提升杀菌效率、降低处理能耗与成本；开发适配食品工业流水线的连续化、自动化 PDI-SAlEW 处理设备。
② 应用场景的多元化拓展：将该技术拓展至单增李斯特菌、沙门氏菌、大肠杆菌等其他食品常见致病菌的单一 / 混合生物被膜清除，应用于果蔬、肉类、水产品等不同食品基质的杀菌保鲜，以及食品加工管道、包装材料、生产设备的原位消毒处理。③ 作用机制的深度解析：结合转录组、蛋白质组、代谢组多组学技术，解析联合技术对混合生物被膜内细菌基因表达、蛋白合成、代谢通路的影响，阐明其分子层面的杀菌机制；系统探究该技术对细菌活的非可培养（VBNC）状态的诱导与消除机制，规避食品安全潜在风险。④ 复合杀菌体系的构建：将 PDI-SAlEW 技术与超声波、脉冲电场、酸性电解水、植物源天然抑菌物质等其他非热杀菌技术联用，构建多机制协同的复合杀菌体系，进一步提升复杂环境中生物被膜的清除效率，延缓细菌抗性的产生。⑤ 工业化应用的安全性与经济性评估：开展中试规模的食品工厂现场试验，评估该技术在实际生产环境中的长期应用稳定性、杀菌效果与经济性；系统验证该技术对食品基质的感官品质、营养成分、理化性质的影响，完善食品工业应用的安全性评价体系。
⑥ 细菌抗性机制的系统研究：探究长期连续处理下，混合菌种对 PDI-SAlEW 联合技术的抗性产生规律、演化路径与分子机制，制定针对性的抗性防控策略，保障技术的长期有效应用。
7. 测量的数据、对应图表及研究意义
① 不同处理条件下混合生物被膜的生物量变化数据
数据内容：测定了不同 SCC 浓度、不同光照能量下，PDI 联合 SAlEW 处理后混合生物被膜的生物量，同时对比空白对照、单独 PDI、单独 SAlEW 的处理效果。
数据来源：Fig 1. Effects of PDI coupled with SAlEW on the biomass of the mixed-species biofilms of V. parahaemolyticus and S. putrefaciens. (A) 20 min (4.56 J/cm²) irradiation under different SCC concentrations; (B) 150 μM SCC under different irradiation time.
研究意义：明确了 PDI 联合 SAlEW 的生物被膜清除效果呈现光敏剂浓度和光照能量依赖性，确定了 150 μM SCC、4.56 J/cm² 光照的最优处理条件，该条件下生物量降低 72.4%，远优于单独处理的效果，直接证实了 PDI 与 SAlEW 的协同增效作用，为后续实验的参数设置提供了核心依据。
② 不同处理后生物被膜的活菌数、细胞活性、再生长能力数据
数据内容：测定了四组处理后混合生物被膜的活菌数、细胞代谢活性，以及 36 h 内细菌的再生长曲线，通过 Baranyi 模型拟合得到迟滞期等生长动力学参数。
数据来源：Fig 2. Changes in the viable cells (A), cell viability (B) and regrowth capability (C) of the mixed-species biofilms after single or coupling treatment of PDI and SAlEW.、Table 1 The kinetic growth parameters of the mixed-species biofilms cells under different conditions.
研究意义：从活菌数、代谢活性、长期再生长能力三个维度，全面证实了联合技术的强效杀菌效果，处理后活菌数减少 3.51 Log CFU/mL、细胞活性下降 85.7%，细菌迟滞期从 3.28 h 延长至 13.51 h；同时排除了细菌进入 VBNC 状态导致的杀菌效果假阳性，为技术的实际杀菌效力提供了全面的定量证据。
③ 不同处理后生物被膜的微观空间结构变化数据
数据内容：通过 CLSM 观察生物被膜三维结构，定量分析生物体积、孔隙率；通过 AFM 观察生物被膜表面形貌，测定表面均方根粗糙度（Rq）。
数据来源：Fig 3. Changes in the spatial structures of the mixed-species biofilms under PDI coupled with SAlEW. (A) CLSM images; (B) Bio-volume; (C) Porosity; (D) AFM images.
研究意义：从微观层面直观证实了联合技术对生物被膜三维结构的强效破坏，处理后生物体积从 1.47×10⁵ μm³ 降至 1.9×10⁴ μm³，孔隙率显著提升，表面粗糙度 Rq 从 219 nm 降至 51 nm；阐明了联合技术通过瓦解生物被膜致密结构、降低细菌黏附能力，进一步提升杀菌效率的作用机制，为宏观杀菌效果提供了微观结构层面的解释。
④ 不同处理体系中单线态氧（¹O₂）的产量数据
数据内容：通过 ABDA 探针法，测定不同 SCC 浓度、不同光照时间下，单独 PDI 与 PDI 联合 SAlEW 体系中 ¹O₂的产量，以 OD₃₉₉ nm 的下降值表征 ¹O₂生成量。
数据来源：Fig 4. Changes in the yield of ¹O₂ in the system of PDI coupled with SAlEW. (A) 20min irradiation under different SCC concentrations; (B) 150 μM SCC under different irradiation time.
研究意义：明确了 SAlEW 可显著提升 SCC 光照下的 ¹O₂产量，而 ¹O₂是 PDI 杀菌的核心活性物质，直接从氧化活性物质生成的角度，阐明了 SAlEW 增强 PDI 杀菌效率的核心化学机制。
⑤ SCC 在不同溶剂中的理化性质数据
数据内容：测定了不同体系的表面张力，以及光照前后 SCC 在两种溶剂中的紫外 - 可见吸收光谱，对比吸光度的变化幅度。
数据来源：Fig 5. Changes in the physicochemical properties of SCC in SAlEW. (A) Surface tension; (B) Absorption spectra.
研究意义：证实了 SAlEW 可显著降低 SCC 溶液的表面张力，提升 SCC 的润湿性、渗透性；同时大幅提升 SCC 的光化学稳定性，减少光敏剂的光降解，保障其持续产生活性氧，进一步阐明了 SAlEW 增强 PDI 效果的理化机制。
⑥ 不同处理后生物被膜 EPS 核心组分的含量数据
数据内容：定量测定了四组处理后，混合生物被膜 EPS 中胞外多糖、胞外蛋白、eDNA 的含量变化。
数据来源：Fig 6. Changes in EPS contents of mixed-species biofilms after single or coupling treatment of PDI and SAlEW. (A) Extracellular polysaccharide; (B) Extracellular protein; (C) Extracellular DNA (eDNA).
研究意义：证实了 PDI 联合 SAlEW 可强效破坏 EPS 的三大核心组分，三者分别降低 52%、44%、56%，远优于单独处理的效果；而 EPS 是生物被膜的结构骨架与抗菌屏障，该结果直接阐明了联合技术瓦解生物被膜防御体系、实现高效杀菌的核心作用机制。
⑦ 不锈钢和鱼鳞表面混合生物被膜的清除效果数据
数据内容：测定了不同处理后，不锈钢和鱼鳞表面混合生物被膜的生物量、活菌数、细胞活性的变化。
数据来源：Fig 7. Effects of PDI coupled with SAlEW treatment on the mixed-species biofilms formed on stainless steel and fish scales. (A, B) Biomass; (C, D) Viable cells of biofilms; (E, F) Cell viability.
研究意义：验证了 PDI 联合 SAlEW 在食品工业真实应用场景中的有效性，对不锈钢和鱼鳞表面生物被膜的细胞活性分别降低 87% 和 86%，证实该技术可有效清除食品接触材料与水产品表面的混合生物被膜，为其工业化应用提供了直接的场景验证数据。
⑧ 不锈钢和鱼鳞表面生物被膜的微观形貌数据
数据内容：通过 SEM 观察不同处理后，不锈钢和鱼鳞表面生物被膜的微观形貌、细菌形态变化。
数据来源：Fig 8. SEM micrographs of the mixed-species biofilms after single or coupling treatment of PDI and SAlEW. (A) Stainless steel; (B) Fish scales.
研究意义：从微观形貌直观证实了联合技术可有效剥离不锈钢和鱼鳞表面的生物被膜，破坏细菌细胞结构，使菌体发生变形、皱缩，为技术的实际应用效果提供了直观的显微证据。
8. 核心研究结论
① 本研究首次选用可饮用级弱碱性电解水（SAlEW）作为食品级光敏剂叶绿素铜钠盐（SCC）的溶剂，构建了光动力灭活（PDI）联合 SAlEW 的新型抗生物被膜技术，实现了对副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌混合菌种生物被膜的高效清除。
② 与单独 PDI 或单独 SAlEW 处理相比，PDI 联合 SAlEW 展现出极强的协同增效作用，在 150 μM SCC、4.56 J/cm² 蓝光照射的最优条件下，可使混合生物被膜的生物量降低 72.4%、活菌数减少 3.51 Log CFU/mL、细胞活性下降 85.7%，同时显著延长残存细菌的生长迟滞期，强效抑制其再生长能力。③ 该联合技术的增效机制为：SAlEW 可显著提升 SCC 的渗透性、润湿性与光化学稳定性，同时大幅增强光照下 SCC 的单线态氧（¹O₂）产量；上述因素共同作用，强效破坏了生物被膜 EPS 的核心组分（胞外多糖、胞外蛋白、eDNA），进而瓦解了生物被膜的三维空间结构，实现对被膜内细菌的高效杀灭。④ PDI 联合 SAlEW 技术对食品工业常见的不锈钢和鱼鳞表面的混合生物被膜同样具备高效清除效果，可使两种表面生物被膜的细胞活性分别降低 87% 和 86% 以上，证实该技术在食品工业真实场景中具备良好的应用潜力。
⑤ 该研究开发了一种安全、高效、绿色的非热杀菌新技术，无有毒试剂残留，适配食品工业的安全要求，为食品工业中食品接触表面、水产品等基质上的有害混合菌种生物被膜污染防控提供了全新的解决方案。
9. 芬兰 Bioscreen 仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰 Bioscreen C MBR 全自动微生物生长曲线分析仪（Oy Growth Curves Ab, Finland），对不同处理后的混合生物被膜细胞进行了 36 小时的生长动态监测，培养温度设置为 25℃，每 2 小时读取一次 OD₆₀₀ nm 值，设置 3 次技术重复，最终获得了不同处理组细菌的全周期生长曲线，并通过 Baranyi 模型拟合得到了迟滞期（λ）等关键生长动力学参数。该生长曲线数据是本研究的核心功能性验证数据，其研究意义体现在以下 8 个关键层面：
① 全面评估了不同处理对生物被膜细胞生长活性的长期抑制效果，弥补了传统终点法检测的局限性
传统的平板计数、MTT 法仅能反映处理后即时的活菌数与细胞代谢活性，无法评估细菌的长期存活与复苏能力。而 Bioscreen 仪器获得的 36 小时连续生长曲线，完整捕捉了生物被膜细胞从迟滞期、对数生长期到平台期的全周期生长动态，可直观、定量地反映不同处理对细菌生长繁殖能力的长期影响。数据显示，PDI 联合 SAlEW 处理后，细菌的迟滞期从空白组的 3.28 h 大幅延长至 13.51 h，直接证实了该联合技术不仅能即时杀灭大部分生物被膜细胞，还能对残存细菌的生长繁殖能力产生强效、持久的抑制作用，避免了杀菌后细菌复苏导致的二次污染风险。
② 验证了处理后细菌是否进入活的非可培养（VBNC）状态，保障了杀菌效果评价的准确性
食品工业中，致病菌在严苛处理条件下易进入 VBNC 状态，此时平板计数法无法检测到活菌，会造成 “完全杀菌” 的假阳性结果，带来严重的食品安全隐患。Bioscreen 仪器的连续生长曲线监测可有效识别这一状态：若细菌进入 VBNC 状态，在适宜的新鲜培养基中仍无法恢复生长，生长曲线无明显上升；而若仅为平板计数无法检出的受损菌，在培养过程中会逐渐复苏并进入对数生长期。本研究中，PDI 联合 SAlEW 处理后的细菌最终仍能进入对数生长期，但迟滞期显著延长，证实处理后残存的细菌并非进入 VBNC 状态，而是生长繁殖能力受到了不可逆的严重损伤，同时也排除了 VBNC 状态对杀菌效果评价的干扰，确保了本研究杀菌效果数据的真实性与准确性。
③ 量化了不同处理方式对细菌生长的抑制程度，直观证实了 PDI 与 SAlEW 的协同增效作用
通过 Baranyi 模型对生长曲线的拟合，获得了不同处理组的定量生长动力学参数，实现了对不同处理抑菌效果的精准量化对比。空白组与单独 PDI 处理组的迟滞期无显著差异（3.28 h vs 3.75 h），单独 SAlEW 处理组迟滞期延长至 7.48 h，而 PDI 联合 SAlEW 处理组迟滞期大幅延长至 13.51 h，其延长幅度远超过单独 PDI 与单独 SAlEW 的加和。该定量数据直接、精准地证实了 PDI 与 SAlEW 在抑制细菌生长方面存在显著的协同增效作用，而非简单的效果叠加，为二者联用的技术合理性提供了核心的定量证据。
④ 为联合技术的实际食品安全应用提供了关键的货架期相关数据
在水产品、生鲜食品的贮藏过程中，残存致病菌的生长繁殖速度直接决定了产品的货架期与食品安全风险。Bioscreen 仪器获得的生长曲线数据，明确了 PDI 联合 SAlEW 处理后，残存的副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌的生长迟滞期被延长 4 倍以上，意味着在食品贮藏过程中，致病菌的增殖起始时间被大幅推迟，可有效延长水产品的安全货架期，降低腐败与食源性疾病的风险。该数据为该技术在水产品保鲜、食品安全防控中的实际应用提供了直接的货架期相关支撑数据。
⑤ 建立了标准化的混合菌种生长活性评价方法，保障了实验数据的重复性与可比性
Bioscreen 仪器的全自动、恒温、同步震荡培养与原位检测特性，最大程度消除了传统摇瓶培养、手动分光光度计检测过程中，环境温度变化、人为操作、批次间差异带来的系统误差。本研究中所有处理组的生长曲线测定均在同一仪器、相同培养参数、同步培养的条件下完成，确保了不同处理组之间生长数据的可比性、重复性与统计学显著性，为整个研究的结论提供了可靠、标准化的实验数据基础。
⑥ 为联合技术的处理参数优化提供了关键的功能性评价指标
在食品工业的实际应用中，不仅需要关注即时的杀菌率，更需要关注处理后细菌的再生长能力，这是决定消毒处理长期有效性的核心指标。Bioscreen 仪器获得的生长曲线与迟滞期数据，可作为核心的功能性评价指标，用于进一步优化光敏剂浓度、光照时间、SAlEW 理化参数等处理条件，筛选出既能实现高效即时杀菌，又能最大程度抑制细菌再生长的最优处理方案，为技术的工业化应用参数优化提供了明确的评价标准。
⑦ 揭示了不同处理对混合菌种协同生长特性的影响，补充了混合生物被膜的抗性机制研究
副溶血性弧菌与腐败希瓦氏菌在混合生物被膜中存在协同生长、协同增强抗性的特性，而不同处理对这种协同生长关系的影响，无法通过单一的活菌数检测全面反映。Bioscreen 仪器获得的混合菌群整体生长曲线，可直观反映处理后混合菌种的协同生长能力变化。数据显示，PDI 联合 SAlEW 处理不仅杀灭了大部分细菌，还严重破坏了两种菌的协同生长关系，导致混合菌群的整体生长能力大幅下降，迟滞期显著延长，从菌群互作的角度补充了联合技术抗混合生物被膜的作用机制，为混合菌种生物被膜的防控研究提供了新的研究视角。
⑧ 拓展了 Bioscreen 仪器在食品非热杀菌技术与生物被膜研究领域的应用场景传统上 Bioscreen 仪器多用于微生物生长特性、菌种筛选、药敏实验等基础研究，本研究将其创新性地应用于光动力灭活联合电解水技术的杀菌效果评价，将生长曲线数据作为生物被膜细胞再生长能力、杀菌长期有效性、VBNC 状态评估的核心指标，建立了一套基于 Bioscreen 生长曲线测定的非热杀菌技术效果评价体系，为同类食品杀菌技术、生物被膜防控技术的研究提供了方法学参考，拓展了该仪器在食品科学与微生物防控领域的应用边界。