Inhibitory effects of fucoidan from Laminaria japonica against some pathogenic bacteria and SARS-CoV-2 depend on its large molecular weight
海带岩藻聚糖对多种致病菌及 SARS-CoV-2 的抑制作用依赖于其高分子量
来源：International Journal of Biological Macromolecules 229 (2023) 413–421
1. 论文摘要
岩藻聚糖是一种高硫酸化多糖，具有包括抗病原活性在内的广泛生物活性，但其抑制病原体感染的构效关系尚不明确。本研究通过光催化降解联合膜超滤技术制备了不同分子量的岩藻聚糖，对比分析了其化学结构与抗病原微生物活性。结果表明，光催化降解可有效解聚岩藻聚糖，且不会明显破坏其结构单元与硫酸基团；5 mg/mL 的天然岩藻聚糖（90.8 kDa）可抑制金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌和大肠杆菌的生长，而其降解产物 Dfuc1（19.2 kDa）和 Dfuc2（5.5 kDa）的抑制作用显著减弱；此外，与低分子量产物相比，天然岩藻聚糖对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌、鼠伤寒沙门氏菌黏附 HT-29 细胞的阻断能力更强，其抗 SARS-CoV-2 的抑制效果与 S 蛋白结合能力也与分子量呈正相关。本研究证实，更高分子量的天然岩藻聚糖能更有效地抑制致病菌与 SARS-CoV-2，为明确岩藻聚糖抗病原微生物的构效关系提供了科学依据。
2. 论文关键词
硫酸化多糖、食源性致病菌、病毒、光催化降解
3. 研究目的
建立一种绿色、高效、不破坏核心结构的岩藻聚糖降解方法，制备分子量梯度明确的岩藻聚糖组分，明确光催化降解对海带岩藻聚糖核心结构的影响。
系统探究分子量对海带岩藻聚糖抗致病菌活性（生长抑制、宿主细胞黏附阻断）和抗 SARS-CoV-2 活性的影响，锁定影响其抗病原活性的核心结构因素。
揭示岩藻聚糖抗病原活性的分子量依赖性机制，明确其构效关系，为岩藻聚糖在天然食品防腐、抗感染功能食品与药物开发中的应用提供理论依据和技术支撑。
4. 研究思路
样品制备阶段：以海带来源天然岩藻聚糖为原料，通过 H₂O₂-TiO₂光催化降解反应，结合不同截留分子量的膜超滤与透析技术，制备两种低分子量岩藻聚糖组分 Dfuc1 和 Dfuc2，与天然高分子量岩藻聚糖形成对照。
结构表征阶段：通过 HPLC、化学组成分析、FT-IR、一维 / 二维 NMR 光谱等手段，全面对比三种岩藻聚糖的分子量、硫酸基团含量、糖醛酸含量、单糖组成、特征官能团、糖链骨架与糖苷键连接方式，明确降解反应对岩藻聚糖核心结构的影响。
抗菌活性评价阶段：利用芬兰 Bioscreen C 全自动生长曲线仪，通过比浊法测定三种岩藻聚糖对 6 种常见食源性致病菌的动态生长抑制作用，分析分子量对岩藻聚糖抑菌活性的影响规律。
抗黏附活性评价阶段：以人结肠上皮 HT-29 细胞为模型，通过平板菌落计数法，测定不同浓度、不同分子量岩藻聚糖对致病菌黏附宿主细胞的抑制作用，明确分子量对抗黏附活性的影响，同时通过细胞毒性实验排除非特异性干扰。
抗病毒活性评价阶段：在三级生物安全实验室开展 SARS-CoV-2 体外中和实验，测定不同分子量岩藻聚糖对病毒感染宿主细胞的抑制效果；结合 ACE2 竞争 ELISA 实验，分析其对 SARS-CoV-2 S 蛋白 RBD 与宿主 ACE2 受体结合的阻断能力，揭示分子量对抗病毒活性的影响及分子机制。
结果整合与结论总结：整合结构表征与活性评价数据，明确岩藻聚糖抗病原活性的分子量依赖性规律，探讨其潜在作用机制，最终形成完整的构效关系结论。
5. 研究亮点
首次系统明确了岩藻聚糖抗病原活性的高分子量依赖性：从细菌生长抑制、宿主黏附阻断、病毒入侵抑制三个层面，全面证实海带岩藻聚糖的抗致病菌、抗 SARS-CoV-2 活性均随分子量升高而显著增强，打破了部分研究中 “低分子量岩藻聚糖活性更高” 的认知，厘清了岩藻聚糖不同生物活性的构效关系差异。
建立了岩藻聚糖的绿色可控降解新方法：证实光催化降解技术可在不破坏岩藻聚糖核心糖链骨架、硫酸基团等活性结构的前提下，实现分子量的高效可控降低，解决了传统酸水解易造成硫酸基团脱落、酶解法成本高且不稳定、物理法设备要求高等行业痛点。
严谨排除干扰变量，锁定分子量为核心活性决定因素：通过全面的结构表征，证实降解前后岩藻聚糖的硫酸化程度、单糖组成、特征官能团、糖链骨架均无显著差异，精准排除了其他结构变量对活性的干扰，为 “分子量是岩藻聚糖抗病原活性核心决定因素” 的结论提供了无可辩驳的实验支撑。
揭示了岩藻聚糖抗 SARS-CoV-2 的构效关系与分子机制：证实岩藻聚糖抗 SARS-CoV-2 的核心机制是阻断病毒 S 蛋白 RBD 与宿主 ACE2 受体的结合，且高分子量岩藻聚糖因具有更多结合位点，展现出更强的阻断活性，为抗新冠病毒天然多糖药物的开发提供了新的候选分子与结构优化方向。
研究成果兼具学术价值与产业化应用潜力：所用原料为食品级海带岩藻聚糖，安全性高、来源广泛，研究明确了其有效抑菌、抗病毒的剂量与活性特征，可直接应用于天然食品防腐剂、抗感染功能食品的开发，实现了理论研究与产业应用的结合。
6. 可延伸的研究方向
构效关系的深度精准解析：进一步分级制备更多窄分布分子量段的岩藻聚糖组分，明确其抗病原活性的临界分子量阈值；结合分子对接、分子动力学模拟，从原子层面揭示岩藻聚糖分子量与致病菌、S 蛋白结合的分子机制，完善其构效关系理论体系。
光催化降解工艺的优化与工业化放大：优化光催化降解的反应参数，实现岩藻聚糖分子量的精准可控降解，同时开展中试放大实验，解决催化剂回收、连续化生产等工程化问题，推动该绿色制备技术的工业化应用。
真实食品体系中的应用验证：在肉类、水产品、即食食品、烘焙食品等真实食品基质中，验证高分子量岩藻聚糖的防腐保鲜效果，优化其在食品中的添加剂量、应用配方与加工工艺，开发新型天然食品防腐剂产品。
体内活性与安全性系统评价：通过动物感染模型，评价高分子量岩藻聚糖在体内对肠道致病菌感染、病毒感染的预防和治疗效果；同时系统开展毒理学、胃肠道消化稳定性、体内代谢与生物利用度研究，全面评估其作为功能食品原料的安全性与有效性。
复合抗病原体系开发：探究高分子量岩藻聚糖与植物精油、细菌素、ε- 聚赖氨酸、其他天然多糖的协同抗病原效应，开发高效、广谱、稳定的复合天然抗菌抗病毒制剂，拓展其在食品、日化、医药领域的应用场景。
活性广谱性拓展研究：探究不同分子量岩藻聚糖对更多食源性耐药菌、真菌、其他包膜病毒（如流感病毒、疱疹病毒、诺如病毒等）的抑制活性，明确其抗病原活性的广谱性，进一步拓展其应用边界。
7. 测量数据、对应图表及研究意义
不同分子量岩藻聚糖的分子量分布、核心化学组成数据
数据来源：Fig. 2 Molecular weight distribution (A) and FT-IR spectra (B) of fucoidan, Dfuc1 and Dfuc2.、Table 1 Chemical compositions of fucoidan, Dfuc1 and Dfuc2.
研究意义：① 明确了光催化降解联合膜超滤成功制备了分子量梯度明确的三种岩藻聚糖：天然岩藻聚糖（90.8 kDa）、Dfuc1（19.2 kDa）、Dfuc2（5.5 kDa），为后续构效关系研究提供了合格的实验材料；② 证实光催化降解仅轻微降低岩藻聚糖的硫酸基团含量，对糖醛酸含量无显著影响，排除了硫酸化程度这一关键活性变量对实验结果的干扰，精准锁定分子量为唯一核心变量；③ 明确了三种岩藻聚糖的单糖组成特征，证实降解未改变单糖种类，仅轻微改变单糖摩尔比，为后续活性差异的机制解释提供了基础结构数据。
不同分子量岩藻聚糖的光谱学结构表征数据
数据来源：Fig. 2B FT-IR spectra of fucoidan, Dfuc1 and Dfuc2.、Fig. 3 ¹H NMR spectra (A), ¹³C NMR spectra (B), and HSQC spectra(C) of fucoidan, Dfuc1 and Dfuc2.、Table 2 Assignments of ¹H and ¹³C NMR signals of fucoidan, Dfuc1 and Dfuc2.
研究意义：① 红外光谱数据证实，降解前后岩藻聚糖的羟基、烷基、糖醛酸羰基、硫酸基团的特征吸收峰无显著差异，证明光催化降解未破坏岩藻聚糖的特征官能团；② 一维与二维 NMR 数据明确了天然岩藻聚糖的核心骨架为 α-1,3 - 连接的 L - 岩藻糖残基（C2/C4 位硫酸化），辅以 1,4 - 连接的 β-D - 甘露糖与 1,6 - 连接的 β-D - 半乳糖残基；③ 证实 Dfuc1 和 Dfuc2 保留了与天然岩藻聚糖完全一致的糖链骨架与糖苷键连接方式，最终证明光催化降解仅通过断裂糖苷键降低分子量，不破坏核心活性结构，为后续活性差异仅源于分子量变化提供了最核心的结构证据。
不同分子量岩藻聚糖对 6 种食源性致病菌的生长抑制动态数据与抑菌率统计数据
数据来源：Fig. 4 Effect of fucoidan, Dfuc1 and Dfuc2 on the growth of E. coli (A), S. flexneri (B), V. parahaemolyticus (C), S. typhimurium (D), S. aureus (E), and L. monocytogenes (F), and the effects of fucoidan, Dfuc1 and Dfuc2 were summarized in (G).
研究意义：① 证实 5 mg/mL 天然高分子量岩藻聚糖对金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌具有显著生长抑制作用，抑菌率分别达 25.9±1.0%、24.1±2.8%、13.2±2.7%，而低分子量降解产物的抑菌活性显著降低，明确了岩藻聚糖抑菌活性的分子量正相关规律；② 完整呈现了 18 小时内致病菌的动态生长过程，明确了岩藻聚糖主要通过降低致病菌对数期生长速率、减少最大生物量发挥抑菌作用，而非仅延长延滞期，为其抑菌机制提供了动态证据；③ 同步对比了 6 种致病菌的响应差异，证实岩藻聚糖对革兰氏阳性菌的抑制效果优于革兰氏阴性菌，且抑菌作用具有菌种选择性，为其靶向应用提供了直接依据。
不同分子量岩藻聚糖对致病菌黏附 HT-29 细胞的抑制作用数据
数据来源：Fig. 5 Effect of fucoidan, Dfuc1 and Dfuc2 on the adherence of foodborne pathogens to HT-29 cells cultures. (A) S. aureus, (B) V. parahaemolyticus, (C) S. typhimurium, (D) L. monocytogenes, (E) S. flexneri, (F). E. coli.、Fig. S4
研究意义：① 证实岩藻聚糖可选择性抑制金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌、鼠伤寒沙门氏菌对肠上皮细胞的黏附，而对福氏志贺菌、大肠杆菌无显著影响，明确了其抗黏附活性的作用范围；② 发现岩藻聚糖的抗黏附活性同样具有显著的分子量依赖性，天然高分子量岩藻聚糖的抑制效果显著优于低分子量组分，尤其对革兰氏阳性菌的阻断作用最为突出，进一步完善了岩藻聚糖抗致病菌的构效关系体系；③ 细胞毒性实验证实实验浓度下的岩藻聚糖对 HT-29 细胞无毒性，排除了细胞死亡对黏附结果的干扰，证明其抗黏附作用是特异性的病原菌 - 宿主结合阻断效应，为岩藻聚糖预防肠道致病菌感染提供了核心的细胞实验证据。
不同分子量岩藻聚糖对 SARS-CoV-2 的体外中和抑制活性数据
数据来源：Fig. 6 Inhibitory activity of fucoidan, Dfuc1 and Dfuc2 against SARS-CoV-2.
研究意义：① 证实 6.25~50 μg/mL 浓度范围内，三种岩藻聚糖均能有效抑制 SARS-CoV-2 对 HeLa 细胞的感染，且抑制活性随分子量升高而显著增强，天然高分子量岩藻聚糖的抗病毒活性最强；② 首次在硫酸化程度无显著差异的前提下，明确了分子量是决定岩藻聚糖抗 SARS-CoV-2 活性的核心因素，填补了该领域的构效关系研究空白。
不同分子量岩藻聚糖对 S 蛋白 RBD 与 ACE2 受体结合的阻断作用数据
数据来源：Fig. 7 Effect of fucoidan, Dfuc1 and Dfuc2 on binding between SARS-CoV-2 S protein RBD and ACE2 by ELISA assay.
研究意义：① 证实三种岩藻聚糖均能有效阻断 SARS-CoV-2 S 蛋白 RBD 与宿主 ACE2 受体的结合，且阻断活性与分子量呈显著正相关，从分子层面解释了岩藻聚糖抗病毒活性的分子量依赖性；② 揭示了岩藻聚糖抗 SARS-CoV-2 的核心作用机制，即通过竞争性阻断病毒与宿主受体的结合，抑制病毒吸附和入侵宿主细胞，为其抗病毒应用提供了明确的机制支撑。
8. 核心研究结论
光催化降解技术可高效解聚海带岩藻聚糖，在显著降低其分子量的同时，不会破坏岩藻聚糖的核心糖链骨架、特征结构单元与硫酸基团，是一种绿色、可控、不破坏活性结构的岩藻聚糖降解新方法。
海带岩藻聚糖的抑菌活性具有显著的分子量依赖性，天然高分子量岩藻聚糖（90.8 kDa）对金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌的生长抑制作用显著优于低分子量降解产物 Dfuc1（19.2 kDa）和 Dfuc2（5.5 kDa），且对革兰氏阳性菌的抑制效果更突出。
海带岩藻聚糖可选择性阻断食源性致病菌对宿主肠上皮细胞的黏附，且抗黏附活性随分子量升高而增强，高分子量岩藻聚糖对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌、副溶血性弧菌、鼠伤寒沙门氏菌黏附 HT-29 细胞的抑制效果显著优于低分子量组分。
海带岩藻聚糖具有显著的抗 SARS-CoV-2 活性，其对病毒感染的抑制效果、对 S 蛋白 RBD 与 ACE2 受体结合的阻断能力均与分子量呈正相关，高分子量岩藻聚糖展现出最强的抗病毒活性。
天然高分子量海带岩藻聚糖对致病菌和 SARS-CoV-2 的抑制作用更显著，分子量是决定岩藻聚糖抗病原活性的核心关键因素，该研究明确了岩藻聚糖抗病原微生物的构效关系，为其在食品防腐、抗感染功能食品开发中的应用提供了重要的理论依据。
9. 芬兰 Bioscreen 仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中，芬兰 Bioscreen C 全自动微生物生长曲线分析仪（Bioscreen C Microbiology Reader, Labsystems, Helsinki, Finland）被核心用于测定 5 mg/mL 浓度下，天然岩藻聚糖、Dfuc1、Dfuc2 对 6 种食源性致病菌 18 小时内的动态生长曲线，对应Fig.4。该仪器测量的生长曲线数据是本研究构效关系分析的核心基础，具体研究意义分为以下 7 个层面：
实现多菌株、多组分的同步检测，保障实验结果的可比性与可靠性
传统的试管培养 + 分光光度计终点法，无法实现多菌株、多组分的同步恒温培养与检测，易出现批次间温度、培养时间、操作误差带来的结果偏差。而 Bioscreen C 的 100 孔蜂窝板可同时对 6 种致病菌、3 种岩藻聚糖组分、空白对照组进行完全同步的 37℃恒温培养与震荡，每 2 小时自动测定 OD₆₀₀ₙₘ值，彻底消除了批次间的系统误差，使得不同分子量岩藻聚糖对不同致病菌的抑菌活性数据具有直接可比性，保障了 “高分子量岩藻聚糖抑菌活性更强” 这一核心结论的严谨性与可重复性。
动态呈现致病菌全生长周期变化，精准量化岩藻聚糖的抑菌效应
传统终点法仅能获得培养结束后的单一 OD 值，无法反映抑菌剂对细菌延滞期、对数期、稳定期的动态影响，易遗漏关键的抑菌特征。而 Bioscreen 仪器获得的 18 小时连续生长曲线，完整呈现了不同分子量岩藻聚糖处理下，致病菌的延滞期时长、对数期生长速率、最大生物量的全周期变化，不仅能计算最终抑菌率，还能精准分析岩藻聚糖对致病菌不同生长阶段的作用模式。例如，数据明确了天然岩藻聚糖主要通过降低致病菌对数期生长速率、减少最大生物量发挥抑菌作用，而低分子量组分对生长曲线的影响极微弱，为岩藻聚糖抑菌活性的分子量依赖性提供了动态、全周期的量化证据。
排除非特异性干扰，明确岩藻聚糖的真实抑菌活性
多糖类物质自身的浊度会干扰 OD 值检测，易造成假阳性或假阴性结果。Bioscreen 仪器的连续动态检测模式，可通过培养基空白对照、多糖空白对照，排除多糖自身浊度对 OD 值的本底干扰；同时通过生长曲线的动态变化趋势，精准区分 “细菌真实增殖” 和 “多糖本底浊度”，最终判定岩藻聚糖对致病菌的真实生长抑制效应，排除了非特异性因素对实验结果的干扰，保障了抑菌活性数据的真实性与准确性。
为构效关系研究提供标准化的定量数据基础
本研究的核心科学问题是明确分子量对岩藻聚糖抑菌活性的影响，而 Bioscreen 仪器提供的标准化培养与检测体系，严格控制了细菌接种量、培养温度、震荡条件、检测时间等所有无关变量，仅保留分子量作为唯一差异因素。基于该仪器获得的生长曲线数据，可精准量化不同分子量岩藻聚糖的抑菌率差异，明确分子量与抑菌活性的正相关关系，为岩藻聚糖抑菌活性的构效关系分析提供了标准化、可重复的定量数据支撑，是本研究核心构效关系结论能够成立的关键实验基础。
明确抑菌活性的菌种选择性，为靶向应用提供直接依据
通过 Bioscreen 仪器同步测定 6 种致病菌的生长曲线，研究可直接对比不同分子量岩藻聚糖对革兰氏阳性菌与革兰氏阴性菌的抑菌活性差异，明确了岩藻聚糖对金黄色葡萄球菌、单增李斯特菌等革兰氏阳性菌的抑制效果更显著，对不同革兰氏阴性菌的抑制作用具有明显的菌种选择性。这一结果为岩藻聚糖的靶向应用提供了直接依据，例如可针对性地将其用于革兰氏阳性菌污染为主的熟肉制品防腐，或金黄色葡萄球菌肠道感染的预防。
为食品防腐产业化应用提供关键工艺参数
Bioscreen 仪器获得的生长曲线数据，明确了岩藻聚糖对致病菌的有效抑菌浓度、作用时效、抑菌强度，这些是食品工业中防腐剂应用的核心工艺参数。例如，数据证实 5 mg/mL 的天然岩藻聚糖在 18 小时内对金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌具有稳定的抑制效果，可直接指导其在即食食品、水产品等品类中的防腐应用，为岩藻聚糖作为天然食品防腐剂的开发提供了关键的剂量参考与时效数据，大幅缩短了从实验室研究到产业化应用的转化周期。
建立多糖类物质抑菌活性的标准化评价方法，具备方法学参考价值
本研究基于 Bioscreen C 系统建立的多糖类物质抑菌活性动态评价方法，具有高通量、自动化、高重复性、动态量化的优势，相比传统方法更适合多糖类天然产物的抑菌活性筛选与构效关系研究。该方法的建立，为后续不同来源、不同结构岩藻聚糖的抑菌活性评价，以及其他海洋硫酸化多糖的抗病原活性筛选提供了标准化的技术方案，对海洋活性多糖的功能评价领域具有重要的方法学参考价值。