The cyclic di-GMP receptor YcgR links the second messenger with the putrescine quorum sensing system in modulation of Dickeya oryzae motility
环二鸟苷酸受体 YcgR 在水稻迪基氏菌运动性调控中连接第二信使与腐胺群体感应系统
来源：mbio July 2025 Volume 16 Issue 7 10.1128/mbio.01016-25
1. 论文摘要
水稻迪基氏菌（Dickeya oryzae）是可侵染多种农作物的常见致病菌，其细胞运动性在宿主侵染和后续系统性感染中发挥关键作用。团队前期研究证实，细菌第二信使 c-di-GMP、腐胺（PUT）介导的群体感应（QS）系统，分别对细菌运动性发挥负向、正向调控作用，对生物膜形成的调控作用则相反。本研究旨在探究这两种信号机制在调控细菌运动性中的潜在互作关系。结果显示，PUT 系统的无义突变对细胞内 c-di-GMP 水平无显著影响，但敲除 c-di-GMP 降解相关编码基因会导致 PUT 合成量显著下降。后续研究发现，第二信使信号系统通过 c-di-GMP 受体 YcgR 与腐胺群体感应系统发生互作；该互作增强了腐胺生物合成途径限速酶 SpeA 的活性，进而提升胞内腐胺水平。关键的是，这种促进效应可被 c-di-GMP 分子抑制，因此 SpeA、YcgR 与 c-di-GMP 共同构成了一个调控回路，通过控制腐胺生物合成速率调控水稻迪基氏菌的运动性。该研究首次揭示了细菌中 c-di-GMP 与腐胺信号系统的互作分子机制。
2. 论文关键词
水稻迪基氏菌、环二鸟苷酸（c-di-GMP）、腐胺、细菌运动性、YcgR 蛋白
3. 研究目的
探究 c-di-GMP 第二信使信号系统与腐胺群体感应系统在调控水稻迪基氏菌运动性中的潜在互作关系与核心分子机制；
明确两种信号系统在细菌运动性调控中的主次地位与协同调控逻辑；
揭示两种在细菌中广泛保守的信号网络，共同调控细菌运动性、毒力及生活方式转换的复杂机制；
填补 c-di-GMP 与多胺群体感应信号交叉调控领域的研究空白，为该病原菌的防控提供新的理论依据与靶点。
4. 研究思路
表型验证：在相同实验条件下，通过游泳运动性实验，验证 c-di-GMP 与 PUT 系统分别对水稻迪基氏菌运动性的负向、正向调控作用，明确二者的表型特征与调控强度差异；
互作方向锁定：通过 LC-MS 分别测定 PUT 缺陷突变株的胞内 c-di-GMP 水平，以及 c-di-GMP 代谢 / 信号转导缺陷突变株的胞内 PUT 水平，明确 c-di-GMP 系统可单向调控 PUT 合成，而 PUT 系统对 c-di-GMP 代谢无显著影响；
调控层面定位：通过转录融合实验，检测 PUT 缺陷对 c-di-GMP 系统相关基因转录的影响，以及 c-di-GMP 系统缺陷对 PUT 合成关键基因转录的影响，发现二者的调控并非主要发生在转录水平，进而聚焦转录后蛋白互作机制；
互作靶点筛选与验证：通过 IP-MS 筛选与 YcgR 互作的 PUT 通路相关蛋白，经细菌双杂交、GST pull-down 实验验证，明确 YcgR 与 PUT 合成限速酶 SpeA 存在直接互作，且该互作不受 c-di-GMP 影响；
分子机制解析：通过体外酶活实验，测定 YcgR 对 SpeA 酶活性的调控作用，以及 c-di-GMP 对该效应的影响，明确 YcgR 可增强 SpeA 催化活性，而 c-di-GMP 可中和该促进作用；
调控主次关系确认：通过异源互补、外源 PUT 添加、基因敲除等实验，分别验证 c-di-GMP 系统对 PUT 缺陷株运动性的影响，以及 PUT 对 c-di-GMP 缺陷株运动性的影响，明确 c-di-GMP 系统在运动性调控中占主导地位；
调控模型构建：整合所有实验结果，构建 SpeA-YcgR-c-di-GMP 的调控回路模型，完整阐明两种信号系统协同调控细菌运动性与生活方式转换的核心逻辑。
5. 研究亮点
首次揭示核心互作机制：首次在细菌中发现并阐明了 c-di-GMP 第二信使信号系统与腐胺群体感应系统的交叉调控分子机制，填补了该领域的研究空白；
发现 YcgR 全新功能模式：打破了大肠杆菌等物种中 “YcgR 直接结合鞭毛马达蛋白调控运动性” 的经典认知，发现水稻迪基氏菌中 YcgR 通过与 SpeA 互作调控腐胺合成，进而调控细菌运动性，拓展了 PilZ 结构域 c-di-GMP 受体的功能边界；
阐明完整调控回路：明确了 SpeA-YcgR-c-di-GMP 构成的负反馈调控回路，揭示了负向调控的 c-di-GMP 系统与正向调控的 PUT 系统，如何协同完成细菌浮游 - 固着生活方式的精准切换；
明确调控的主次关系：证实了在水稻迪基氏菌运动性调控中，c-di-GMP 信号系统相较于 PUT 群体感应系统占据绝对主导地位，为该病原菌的毒力调控与靶点筛选提供了核心依据；
提供普适性研究范式：为解析其他革兰氏阴性致病菌中，广泛保守的 c-di-GMP 信号与多胺群体感应信号的交叉调控提供了全新的研究范式，具有重要的领域参考价值。
6. 可延伸的研究方向
探究该调控回路在其他Dickeya属病原菌、甚至其他革兰氏阴性致病菌中的保守性，明确该机制是否为细菌中普遍存在的信号交叉调控模式；
解析 YcgR 与 SpeA 蛋白互作的结构基础，明确二者互作的关键结构域与氨基酸位点，为靶向该互作的抑菌药物开发提供结构依据；
探究该调控回路在水稻迪基氏菌侵染宿主过程中的动态变化，明确其在植物 - 病原菌互作、宿主定殖与系统性感染中的具体作用；
研究该调控回路对水稻迪基氏菌其他毒力表型（胞外酶分泌、毒素合成、生物膜形成、抗生素抗性）的调控作用，全面解析其在病原菌致病过程中的功能；
基于该调控机制，开发靶向 YcgR-SpeA 互作或 c-di-GMP 代谢的新型病害防控策略，用于水稻、香蕉等作物的细菌性软腐病防治；
探究 YcgR 互作的其他 PUT 通路蛋白（ArtP、ArgG、MetK）的生物学功能，明确其是否也参与 c-di-GMP 与 PUT 系统的交叉调控网络。
7. 测量数据、对应图表及研究意义
水稻迪基氏菌野生型 EC1 及 PUT 合成 / 转运缺陷突变株（ΔspeA、ΔspeAΔpotFΔplaP）的游泳运动性数据，外源添加 0.1 mM PUT 后的运动性恢复数据；c-di-GMP 合成缺陷突变株 15ΔDGC、降解缺陷突变株 7ΔPDE 及其互补菌株的游泳运动性数据。
数据来源：FIG 1 Second messenger c-di-GMP and PUT QS system play a negative and positive role, respectively, in the regulation of D. oryzae swimming motility.
研究意义：直接验证了 PUT 群体感应系统对水稻迪基氏菌游泳运动性的正向调控作用，以及 c-di-GMP 对运动性的负向调控作用，为后续探究二者的互作奠定了表型基础，同时明确了两种信号系统对运动性的调控强度差异。
野生型 EC1 与 PUT 缺陷突变株 ΔspeAΔpotFΔplaP 在不同生长阶段（OD600=0.5、1.0、1.5、2.0）的胞内 c-di-GMP 水平定量数据。
数据来源：FIG 2A Cellular c-di-GMP and putrescine levels in D. oryzae EC1 and its derivatives.
研究意义：明确了 PUT 系统的缺陷不会对胞内 c-di-GMP 的代谢产生显著影响，排除了 PUT 系统通过调控 c-di-GMP 水平影响运动性的可能，确定了两种信号系统的调控方向为 c-di-GMP 系统对 PUT 系统的单向调控。
野生型 EC1、c-di-GMP 信号转导缺陷株 ΔycgR、降解缺陷株 7ΔPDE、双突变株 7ΔPDEΔycgR、合成缺陷株 15ΔDGC 在不同生长阶段的胞内 PUT 浓度定量数据；ΔycgR、7ΔPDE 互补菌株的胞内 PUT 水平数据。
数据来源：FIG 2B、FIG 2C Cellular c-di-GMP and putrescine levels in D. oryzae EC1 and its derivatives.
研究意义：证实了胞内 c-di-GMP 的积累、以及 c-di-GMP 受体 YcgR 的缺失，都会显著下调 PUT 的生物合成，明确了 c-di-GMP 及其受体 YcgR 是调控 PUT 合成的关键因子，为后续二者的分子互作研究提供了直接的生化证据。
PUT 缺陷突变株 ΔspeAΔpotFΔplaP 中，c-di-GMP 代谢相关基因（ddgcA、dpdeA、dpdeB）与受体基因 ycgR 在不同生长阶段的转录水平数据。
数据来源：FIG 3A Transcriptional fusion assay of the genes encoding the c-di-GMP signaling system and PUT QS system in wild-type strain EC1 and corresponding mutants.
研究意义：发现 PUT 缺陷会小幅下调 c-di-GMP 系统相关基因的转录表达，为两种信号系统的相互调控提供了转录层面的补充证据，同时也明确二者的核心调控并非发生在转录水平，为后续聚焦转录后调控提供了依据。
ΔycgR、7ΔPDE 突变株中，PUT 合成关键基因 speA、speC 在不同生长阶段的转录水平数据。
数据来源：FIG 3B、FIG 3C Transcriptional fusion assay of the genes encoding the c-di-GMP signaling system and PUT QS system in wild-type strain EC1 and corresponding mutants.
研究意义：明确了 c-di-GMP 系统缺陷对 speA、speC 的转录水平影响极小，与前文胞内 PUT 水平显著下降的表型不符，由此推断 c-di-GMP 对 PUT 合成的调控并非发生在转录水平，而是发生在转录后 / 蛋白互作层面，为后续的蛋白互作研究指明了方向。
与 YcgR 存在潜在互作的 PUT 生物合成通路相关蛋白的筛选数据，包括互作蛋白的基因、ORF、蛋白名称、Unique Pep Count。
数据来源：TABLE 1 The proteins interacting with YcgR identified by Co-IP and protein profile analysis.
研究意义：通过 IP-MS 筛选到 7 个可能与 YcgR 互作的 PUT 通路相关蛋白，为后续验证二者的直接互作、明确调控的分子靶点提供了候选范围。
细菌双杂交实验验证 YcgR 与候选蛋白（SpeA、ArgG、ArtP、MetK）的直接互作数据；GST pull-down 实验验证 YcgR 与 SpeA 的体外互作，以及 c-di-GMP 对该互作的影响数据。
数据来源：FIG 4 Identification of proteins potentially interacting with YcgR.
研究意义：证实了 YcgR 与 SpeA、ArtP、ArgG、MetK 存在直接的蛋白互作，其中与 SpeA 的互作最强；同时明确了 c-di-GMP 不会影响 YcgR 与 SpeA 的体外结合，为后续解析二者的互作功能提供了核心证据，也排除了 c-di-GMP 通过阻断二者结合发挥调控作用的可能。
体外酶活实验中，不同比例 YcgR 存在下 SpeA 的酶活性数据（产物胍丁胺的生成量），以及添加 c-di-GMP 后 SpeA 酶活性的变化数据。
数据来源：FIG 5 Addition of YcgR promotes SpeA enzymatic activity.
研究意义：直接证实了 YcgR 可显著增强 SpeA 的酶促活性，且该促进效应可被等摩尔比的 c-di-GMP 完全中和，明确了 c-di-GMP、YcgR、SpeA 三者的调控关系，揭示了 c-di-GMP 调控 PUT 合成的核心分子机制。
c-di-GMP 降解酶 RocR 在 PUT 缺陷突变株（ΔspeAΔpotFΔplaP、ΔspeAΔspeC）中异源表达后，菌株的游泳运动性数据；外源添加 0.1 mM PUT 对野生型 EC1、15ΔDGC、7ΔPDE 菌株游泳运动性的影响数据；speA 基因敲除对 15ΔDGC、7ΔPDE 菌株游泳运动性的影响数据。
数据来源：FIG 6 Relative strength of c-di-GMP and PUT signaling systems in regulation of bacterial motility.
研究意义：明确了在水稻迪基氏菌运动性的调控中，c-di-GMP 信号系统相较于 PUT 群体感应系统占据绝对主导地位，完善了两种信号系统的协同调控逻辑。
野生型 EC1 与 ΔspeAΔspeC 双突变株在基本培养基（MM）中的生长曲线数据。
数据来源：Fig S1（补充材料）
研究意义：明确了 PUT 合成完全缺陷的 ΔspeAΔspeC 菌株在 MM 中生长速率显著慢于野生型，因此选择 ΔspeAΔpotFΔplaP 突变株进行后续的 c-di-GMP 水平测定实验，保证了实验菌株的生长状态一致，排除了生长速率差异对实验结果的干扰。
LB 培养基中野生型 EC1、ΔycgR、7ΔPDE 及其互补菌株的胞内 PUT 水平数据。
数据来源：Fig S2（补充材料）
研究意义：验证了在 LB 培养基中，c-di-GMP 积累与 YcgR 缺失同样会导致 PUT 合成下降，与 MM 中的实验结果一致，证实了该调控效应不依赖于培养基类型，具有普遍性。
野生型 EC1、ΔycgR 突变株及其互补菌株的游泳运动性与生物膜形成数据。
数据来源：Fig S3（补充材料）
研究意义：验证了 YcgR 在水稻迪基氏菌中对运动性的负向调控、对生物膜形成的正向调控作用，为后续研究 YcgR 的功能奠定了表型基础。
ΔspeA、ΔargG、ΔartP、ΔmetK 突变株的游泳运动性与生物膜形成数据。
数据来源：Fig S4（补充材料）
研究意义：明确了在 YcgR 互作的 4 个 PUT 通路蛋白中，只有 SpeA 的缺失会显著影响细菌的运动性与生物膜形成，确定了 SpeA 是 YcgR 调控 PUT 系统与运动性的核心靶点。
细菌双杂交与 pull-down 实验验证 YcgR 与鞭毛蛋白 FliM、FliG、MotC 同源物的互作数据。
数据来源：Fig S5（补充材料）
研究意义：证实了水稻迪基氏菌中 YcgR 不与鞭毛马达蛋白发生互作，明确了该物种中 YcgR 调控运动性的机制不同于大肠杆菌等物种的经典模式，凸显了本研究新机制的创新性。
ΔspeA、ΔspeAΔycgR 突变株及 ycgR 过表达菌株的游泳运动性数据。
数据来源：Fig S6（补充材料）
研究意义：证实了即使在 PUT 合成关键基因 speA 缺失的背景下，YcgR 仍能调控细菌的运动性，进一步佐证了 c-di-GMP-YcgR 系统在运动性调控中的主导地位。
ΔspeAΔpotFΔplaP 突变株与 rocR 过表达菌株的胞内 PUT 水平数据。
数据来源：Fig S7（补充材料）
研究意义：排除了 RocR 过表达通过提升 PUT 合成来恢复 PUT 缺陷株运动性的可能，直接证实了 c-di-GMP 水平下降对运动性的促进作用不依赖于 PUT 系统，进一步验证了 c-di-GMP 系统的主导地位。
8. 核心研究结论
水稻迪基氏菌中，腐胺群体感应系统对细菌游泳运动性发挥正向调控作用，第二信使 c-di-GMP 对运动性发挥负向调控作用，二者共同调控细菌浮游 - 固着生活方式的转换。
c-di-GMP 信号系统与 PUT 群体感应系统存在单向核心调控关系：PUT 系统缺陷对胞内 c-di-GMP 水平无显著影响，而 c-di-GMP 的积累、c-di-GMP 受体 YcgR 的缺失，会显著抑制 PUT 的生物合成。
c-di-GMP 对 PUT 合成的调控并非发生在转录水平，而是通过转录后蛋白互作实现：YcgR 可与 PUT 生物合成途径的限速酶 SpeA 发生直接蛋白互作，且该互作不受 c-di-GMP 的影响。
YcgR 可显著增强 SpeA 的酶促活性，进而提升胞内 PUT 的合成水平，而 c-di-GMP 与 YcgR 的结合可完全中和该促进效应；SpeA、YcgR、c-di-GMP 三者构成了完整的调控回路，协同调控细菌的运动性。
水稻迪基氏菌中 YcgR 调控运动性的机制具有物种特异性：不同于大肠杆菌等物种中 YcgR 直接结合鞭毛马达蛋白调控运动的经典模式，其主要通过调控 PUT 的合成来影响细菌运动性，拓展了 PilZ 家族 c-di-GMP 受体的功能认知。
在水稻迪基氏菌运动性的调控中，c-di-GMP 信号系统相较于 PUT 群体感应系统占据绝对主导地位，c-di-GMP 的水平变化可完全覆盖 PUT 系统缺陷对运动性的影响。
本研究首次揭示了细菌中 c-di-GMP 第二信使信号系统与腐胺群体感应系统的互作分子机制，为理解细菌复杂的信号调控网络、开发新型病原菌防控策略提供了全新的理论依据与作用靶点。
9. 芬兰 Bioscreen 仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究中使用芬兰 Bioscreen C 全自动生长曲线分析仪，测定了水稻迪基氏菌野生型 EC1 与 PUT 合成完全缺陷株 ΔspeAΔspeC 在基本培养基（MM）中的动态生长曲线，该数据是整个研究实验设计的关键基础，核心研究意义分为以下 4 个层面：
核心实验菌株选择的决定性依据
本研究的核心生化实验需要在 MM 培养基中测定不同菌株的胞内 c-di-GMP 与 PUT 水平，而细菌的生长状态会直接影响胞内第二信使、代谢物的定量结果。Bioscreen 仪器的自动化连续监测，精准呈现了 ΔspeAΔspeC 双突变株在 MM 中生长速率显著慢于野生型 EC1 的表型，若使用该菌株进行后续实验，生长速率的差异会成为关键干扰变量，无法区分胞内 c-di-GMP 水平的变化是由 PUT 缺陷导致，还是由生长状态差异导致。该生长曲线数据直接决定了后续实验选择 ΔspeAΔpotFΔplaP 突变株（而非 ΔspeAΔspeC）作为 PUT 缺陷的研究材料，保证了实验组与对照组菌株的生长状态基本一致，从根源上排除了生长差异对核心实验结果的干扰，确保了实验结论的可靠性。
验证腐胺对病原菌基础生长的生理必要性
Bioscreen 仪器的高分辨率动态监测，完整呈现了 PUT 合成完全缺失后，菌株在营养匮乏的 MM 培养基中的生长缺陷，证实了腐胺作为核心多胺，是水稻迪基氏菌在低营养环境下维持正常生长的必需代谢物。该结果补充了多胺在该病原菌基础生理代谢中的功能认知，也为理解 PUT 作为群体感应信号的生理基础提供了支撑 ——PUT 首先是细菌正常生长的必需代谢物，只有在细菌生长达到一定种群密度时，其群体感应调控功能才会充分发挥作用。
为全实验流程提供严谨的方法学支撑
芬兰 Bioscreen C 是微生物生长曲线测定的金标准设备，其自动化恒温培养、连续震荡、定时 OD 值检测的特性，可实现无人工干预的多重复、长时间动态监测，相较于传统手动分光光度计测定，大幅降低了人为操作误差，保证了生长曲线数据的高重复性与准确性。基于该仪器获得的生长数据，为后续所有实验的取样时间点选择（OD600=0.5、1.0、1.5、2.0）提供了精准依据，确保了不同菌株在相同的生长阶段取样，保证了转录水平测定、胞内代谢物定量等实验的样本同质性，是整个研究实验设计严谨性的重要基础。
为表型实验结果提供关键对照依据
该生长曲线数据明确了不同 PUT 缺陷菌株的生长特性，为后续的游泳运动性、生物膜形成等表型实验提供了关键的对照基准，可有效区分菌株表型的变化是由基因敲除直接导致的调控通路改变，还是由菌株生长缺陷间接导致的非特异性影响，排除了 “生长变慢直接导致运动性下降” 的可能性，进一步佐证了 PUT 对运动性的调控是特异性的信号调控作用，而非非特异性的生长影响。