Development of a non-target metabolomics-based screening method for elucidating metabolic and probiotic potential of bifidobacteria
基于非靶向代谢组学的双歧杆菌代谢与益生潜力筛选方法的建立
来源：Innovative Food Science and Emerging Technologies 77 (2022) 102971
1.论文摘要总结
传统的益生菌体外筛选方法往往无法全面呈现候选菌株的代谢组学全貌，因此本研究旨在建立一种基于非靶向代谢组学的方法，从更全面的视角完成双歧杆菌的筛选工作。研究首先对比了双歧杆菌胞内代谢物的不同提取方法，最终确定珠磨联合超声的甲醇提取法为最优方案，该方法能获得最高的代谢组信号强度和覆盖度。多变量分析结果显示，不同种/株双歧杆菌的胞内代谢组存在显著差异，从中鉴定出14种已被报道具有益生功能的差异代谢物。其中，动物双歧杆菌乳亚种Probio-M8（M8）的胞内乳糖含量显著高于其他受试菌株，但其在稳定期的细胞密度和活菌数更低；在培养基中添加乳糖可显著促进M8菌株的生长，而对其他受试双歧杆菌无明显促生长作用。本研究为益生菌候选菌株的筛选提供了全新的方法和实用数据，为后续菌株的体内功能验证缩小了筛选范围。
2.论文关键词（中文）
非靶向代谢组学、体外筛选流程、代谢与益生潜力、双歧杆菌
3.研究目的
1.核心目的：建立一种基于非靶向代谢组学的体外筛选方法，实现对双歧杆菌代谢特性和益生潜力的快速、高效、多维度评估，弥补传统益生菌筛选方法的局限性。
2.方法学目标：对比并优化适用于双歧杆菌胞内代谢物的提取方案，建立标准化的双歧杆菌非靶向代谢组学分析流程，实现代谢物检测的高覆盖度、高信号强度和高稳定性。
3.机制解析目标：解析不同双歧杆菌菌株的胞内代谢组差异，筛选具有益生功能的关键差异代谢物，揭示双歧杆菌菌株特异性的碳水化合物代谢通路与益生功能的关联。
4.应用目标：基于代谢组学数据实现菌株生长特性的定向优化，为双歧杆菌的工业化发酵提供理论依据；同时为益生菌体内功能验证实验缩小候选菌株范围，大幅提升益生菌菌株筛选的成本效益。
4.研究思路
1.代谢物提取方法优化：以4株双歧杆菌的混合菌体为材料，平行对比4种主流胞内代谢物提取方法（冻融循环法、沸腾乙醇法、冷甲醇法、珠磨+超声辅助甲醇提取法），通过UPLC-Q-TOF-MS检测代谢物检出数量、信号强度和色谱峰分布，筛选出最优提取方案。
2.代谢组学分析体系验证：通过质控样品（QC）的保留时间、峰面积相对标准偏差（RSD），结合PCA聚类分析，验证建立的非靶向代谢组学检测体系的稳定性、重复性和可靠性。
3.菌株胞内代谢组学检测：对3个物种的4株双歧杆菌（M8、V9、BB2798、Bi8762）进行厌氧培养，收集对数生长末期的菌体，采用最优方法提取胞内代谢物，完成非靶向代谢组学检测，分析菌株间的共有代谢物、特有代谢物及整体代谢组差异。
4.差异代谢物筛选与功能注释：通过Kruskal-Wallis秩和检验筛选菌株间的显著差异代谢物，结合PLS-DA模型的VIP值锁定核心差异代谢物；通过质谱数据库匹配完成代谢物鉴定，结合已发表文献解析差异代谢物的益生功能，构建菌株特异性的益生功能预测模型。
5.碳水化合物代谢通路重构与实验验证：基于已发表的双歧杆菌基因组信息，重构碳水化合物摄取与代谢模型，结合代谢组数据解析菌株的糖代谢偏好；针对M8菌株的乳糖代谢特征，通过外源添加乳糖的生长实验，验证代谢组预测结果的准确性，完成菌株生长的定向优化。
6.方法学总结与结论输出：整合所有实验结果，证实非靶向代谢组学在双歧杆菌益生潜力筛选中的应用价值，建立完整的基于代谢组学的益生菌筛选技术流程，为双歧杆菌的工业化应用提供技术支撑。
5.研究亮点
1.首次建立了基于非靶向代谢组学的双歧杆菌益生潜力筛选体系，突破了传统体外筛选仅聚焦耐酸耐胆盐、抑菌性等单一表型的局限，从代谢功能层面实现了益生菌益生潜力的全面、高通量评估，为益生菌菌株筛选提供了全新的技术范式。
2.确立了双歧杆菌胞内代谢物的标准化提取方案，系统对比4种主流提取方法，证实珠磨+超声辅助甲醇提取法能实现代谢物检出数量、信号强度、极性覆盖度的最优表现，填补了双歧杆菌胞内代谢组学样品前处理缺乏标准化方案的行业空白。
3.从代谢组层面证实了益生菌功能的菌株特异性，发现即使是同一物种的不同菌株（M8与V9同属动物双歧杆菌乳亚种），其胞内代谢组、碳水化合物代谢偏好、益生功能相关代谢物也存在显著差异，为“益生菌功能具有菌株特异性”提供了直接的代谢组学证据。
4.实现了菌株生长特性的精准预测与定向优化，基于代谢组数据发现M8菌株的乳糖代谢偏好，通过外源添加乳糖成功将该菌株的活菌数提升至与优势菌株相当的水平，解决了该fastidious菌株在常规培养基中生长能力弱的行业痛点，为双歧杆菌工业发酵培养基优化提供了全新的思路。
5.构建了益生菌特定功能的定向筛选模型，鉴定出14种具有明确人体健康促进作用的差异代谢物，可基于菌株的代谢物特征，定向筛选具有降脂抗心血管疾病、神经调节抗抑郁、抗炎、抗氧化等特定功能的候选菌株，大幅降低了后续体内验证的实验成本与周期。
6.可延伸的研究方向
1.扩大受试菌株的物种范围和菌株数量，建立双歧杆菌不同种/株的代谢组与益生功能关联数据库，完善基于代谢组学的益生菌功能精准预测模型。
2.结合基因组、转录组、蛋白质组开展多组学联合分析，深入解析双歧杆菌菌株特异性代谢特征的分子调控机制，挖掘关键益生代谢物合成的功能基因与调控元件。
3.通过动物实验和人体临床试验，验证基于代谢组学筛选出的候选菌株的体内益生功能，明确该筛选方法对菌株体内功能预测的有效性和准确性。
4.结合靶向代谢组学对14种核心益生功能代谢物进行绝对定量，建立标准化的益生菌代谢潜力定量评估体系，实现菌株益生功能的量化分级。
5.利用该代谢组学方法探究双歧杆菌在不同发酵条件、胁迫环境下的代谢组变化，结合Bioscreen生长曲线检测，优化菌株的工业发酵工艺、冻干保护剂配方，提升益生菌产品的活菌数与储存稳定性。
6.将该非靶向代谢组学筛选方法拓展至乳杆菌、链球菌等其他常用益生菌种，建立通用型的益生菌代谢与益生潜力筛选技术平台。
7.深入解析双歧杆菌中鼠李糖、水苏糖的新型代谢通路，挖掘相关的转运蛋白与功能酶，拓展对双歧杆菌碳水化合物代谢的基础认知。
7.测量的数据及研究意义（对应原论文图表）
1.4种代谢物提取方法的总离子流图（TIC）、基峰强度、代谢物检出数量数据，来自Fig.1A、Fig.1B。
研究意义：直观对比了4种提取方法的提取效率，证实珠磨+超声辅助甲醇提取法的代谢物检出数量最多、信号强度最高、极性覆盖范围最广，为后续双歧杆菌胞内代谢组学分析确立了最优的样品前处理方案，从源头上保障了代谢组数据的全面性、准确性和可靠性。
2.4株双歧杆菌的高质量代谢物数量、代谢物分布韦恩图、特有代谢物鉴定数量、代谢组PCA聚类分析数据，来自Fig.2A、Fig.2B、Fig.2C、Fig.2D。
研究意义：明确了4株双歧杆菌的代谢物检出规模无显著差异，但菌株间的代谢组组成存在本质区别，每株菌均拥有大量特有代谢物；PCA分析中不同菌株的代谢组完全分离，从整体层面证实了双歧杆菌胞内代谢组的物种和菌株特异性，为后续差异代谢物筛选和菌株功能分型奠定了核心数据基础。
3. 菌株间显著差异代谢物数量、PLS-DA模型聚类结果、63个核心差异代谢物的相对丰度热图数据，来自Fig.3A、Fig.3B、Fig.3C。
研究意义：通过非参数检验筛选出1998个菌株间的显著差异代谢物，经PLS-DA模型进一步锁定63个核心差异代谢物（VIP>1），明确了不同菌株的特征代谢标志物；同时PLS-DA模型的高拟合度（R2=0.9928）和高预测能力（Q2=0.9985），证实了代谢组特征可有效区分不同双歧杆菌菌株，为菌株的代谢分型和功能定向筛选提供了核心依据。
4.双歧杆菌碳水化合物摄取与代谢重构模型、菌株特异性糖代谢特征数据，来自Fig.4。
研究意义：系统重构了双歧杆菌的碳水化合物转运与代谢通路，结合代谢组数据明确了4株菌的糖代谢偏好，首次在双歧杆菌中检测到鼠李糖和水苏糖的代谢相关特征，揭示了双歧杆菌潜在的新型碳水化合物代谢通路；同时证实了菌株的代谢特征与其分离来源的环境适应性高度相关，为菌株的培养基优化和工业化发酵提供了理论支撑。
5.4株双歧杆菌的生长曲线、稳定期活菌数数据，以及乳糖添加后M8菌株的生长曲线和活菌数变化数据，来自Fig.5A、Fig.5B、Fig.5C、Fig.5D。
研究意义：明确了4株菌在常规TPY培养基中的生长特性差异，证实M8菌株的生长能力显著弱于其他菌株；通过外源添加乳糖的验证实验，直接证实了基于代谢组数据预测的菌株糖代谢偏好的准确性，成功实现了M8菌株生长能力的定向优化，为该菌株的工业化发酵生产提供了直接的工艺优化方案。
6.基于差异代谢物的双歧杆菌菌株特异性益生功能模型数据，来自Fig.6。
研究意义：鉴定出14种具有明确人体健康促进作用的差异代谢物，构建了菌株特异性的益生功能预测模型，明确了不同菌株的功能优势方向（M8的降脂护心血管、V9的神经调节抗抑郁、BB2798的抗炎、Bi8762的抗氧化），为后续菌株的体内功能验证指明了方向，实现了益生菌特定功能的定向筛选。
8.研究结论
1.本研究首次证实，非靶向代谢组学可在菌株水平实现功能双歧杆菌的快速、高效筛选，该方法虽不能完全替代传统的体外和体内益生菌评价实验，但可为筛选值得进一步功能分析的菌株、设计体内验证实验提供实用的参考信息，将其纳入益生菌菌株筛选流程，可大幅提升筛选效率，推动双歧杆菌的工业化生产与应用。
2.珠磨+超声辅助的甲醇提取法是双歧杆菌胞内代谢物的最优提取方案，可实现代谢物检出数量、信号强度和极性覆盖度的最大化，为双歧杆菌胞内代谢组学研究建立了标准化的样品前处理方法。
3.不同种、甚至同一物种不同菌株的双歧杆菌，其胞内代谢组存在显著差异，在碳水化合物代谢和益生功能相关代谢物谱上表现出极强的菌株特异性，这种特异性与菌株的分离来源和环境适应性高度相关。
4.基于代谢组学数据可精准预测双歧杆菌的碳水化合物代谢偏好，并实现菌株生长特性的定向优化：动物双歧杆菌乳亚种M8具有显著的乳糖代谢偏好，在培养基中添加外源乳糖可显著提升其活菌数和生长能力，解决了该菌株在常规无乳糖培养基中生长能力弱的问题。
5.不同双歧杆菌菌株具有特征性的益生功能相关代谢物谱，可基于代谢组特征定向筛选具有降脂、抗心血管疾病、神经调节、抗炎、抗氧化等特定健康功能的益生菌候选菌株，实现益生菌的功能化定向筛选。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰GrowthcurvesABLtd公司生产的BioscreenC全自动微生物生长曲线分析仪，测定了4株双歧杆菌（M8、V9、BB2798、Bi8762）在37℃厌氧条件下24h内的生长曲线，每1小时记录一次OD600值；同时还测定了培养基中添加0.5%、1%乳糖后，M8和V9菌株的生长曲线，获得了菌株完整的生长动力学数据。这些生长曲线数据的核心研究意义分为以下7个维度：
1.为代谢组学实验确定了标准化的取样时间点，保障了组学数据的可比性
生长曲线数据明确了4株双歧杆菌的生长周期规律：0-4h为延滞期，4h后进入对数生长期，24h达到对数生长末期/稳定期初期。基于此，研究确定了24h为菌体收集和胞内代谢物提取的统一取样时间点，确保了4株菌的取样均处于生理状态一致的生长阶段，彻底排除了菌株生长周期不同对代谢组学结果的干扰，保障了不同菌株间代谢组数据的可比性和生物学意义，避免了因取样时间偏差导致的“假阳性”差异代谢物。
2.揭示了菌株间的生长能力差异，为代谢组学结果的解读提供了关键表型支撑
生长曲线数据和对应的平板活菌计数结果证实，4株菌在相同的TPY培养基中表现出显著的生长能力分化：V9菌株的稳定期活菌数最高（72×10?CFU/mL），而M8菌株的活菌数最低（20×10?CFU/mL）。这一表型数据与代谢组学发现的“M8菌株胞内乳糖含量显著高于其他菌株”形成了完美的相互印证，为后续提出“M8菌株具有乳糖代谢偏好，无乳糖的TPY培养基限制了其生长”的科学假设提供了直接的表型依据，搭建起了菌株代谢特征与生长表型之间的关联桥梁。
3.验证了代谢组学预测结果的准确性，完成了菌株生长优化的闭环验证
研究基于代谢组数据预测M8菌株偏好利用乳糖作为碳源，随后通过在培养基中添加外源乳糖，再次利用BioscreenC仪器精准测定了M8菌株的生长曲线。结果显示，添加0.5%和1%乳糖后，M8菌株的OD600值和稳定期活菌数均显著提升，生长能力与V9菌株无显著差异，而乳糖添加对V9菌株的生长无明显促进作用。这一验证实验直接证实了基于非靶向代谢组学数据预测菌株营养代谢偏好的准确性，同时也证明了BioscreenC生长曲线数据是评估菌株生长优化效果的核心量化指标，为双歧杆菌工业发酵培养基的定向优化提供了完整、可复制的技术范式。
4.实现了多菌株平行实验的高通量自动化监测，保障了实验结果的可靠性
BioscreenC仪器可同时完成上百个样本的全自动生长监测，本研究中4株菌的生长曲线均设置了多生物学重复，所有样本在完全一致的温度、厌氧环境、振荡条件下同步培养与检测，彻底消除了人工分批培养带来的批次间环境差异。同时，仪器每1小时一次的高频自动检测，避免了人工取样检测带来的操作误差、样品污染和环境干扰，多重复的连续生长数据也为统计分析提供了充足的样本量，保障了4株菌生长特性比较结果的统计学显著性。
5.为菌株的工业化发酵生产提供了核心基础工艺参数
BioscreenC仪器获得的高精度生长曲线数据，精准量化了4株双歧杆菌的延滞期时长、对数生长速率、最大生物量、稳定期起始时间等关键发酵工艺参数。这些数据可直接用于指导菌株工业化发酵的接种量控制、发酵周期设定、菌体最佳收获时间节点的选择；尤其是乳糖优化后M8菌株的生长曲线数据，为该菌株的规模化发酵生产提供了直接的工艺基础，大幅缩短了工业化发酵工艺的研发周期，降低了工艺优化的试错成本。
6.完善了益生菌菌株的综合评价体系，提升了筛选结果的实用价值
本研究的核心是建立基于代谢组学的益生菌筛选方法，而BioscreenC测定的生长曲线数据，补充了菌株的生长速率、营养适应性、工业化发酵潜力等核心表型特征。将代谢组学的“益生功能数据”与生长曲线的“工业化应用性能数据”结合，建立了“代谢功能+生长性能”的双重益生菌评价标准，避免了筛选出“功能优异但无法规模化生产”的菌株，大幅提升了筛选结果的工业实用价值。
7.为双歧杆菌的后续功能研究提供了标准化的方法学支撑
本研究建立的基于BioscreenC的双歧杆菌生长曲线测定方法，可快速拓展应用于菌株耐酸、耐胆盐、耐氧等益生菌核心特性的高通量检测，也可用于不同培养基配方、发酵条件、保护剂配方的快速筛选优化。相较于传统的人工取样、平板计数法，该方法可将实验周期从数天缩短至数十小时，同时大幅减少人工操作误差，为双歧杆菌的后续功能研究、胁迫抗性评价、工业化应用开发提供了标准化、高通量的生长特性检测方法。