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Development of an endogenous type I-E CRISPR-Cas-based gene editing tool for Halomonas nigrificans X339: Applications in enhancing poly (3-hydroxybutyrate-co-3-hydroxyvalerate) production

基于内源 I-E 型 CRISPR-Cas 系统的嗜黑盐单胞菌 X339 基因编辑工具开发及其在提升聚 (3 - 羟基丁酸酯 - co-3 - 羟基戊酸酯) 产量中的应用

来源：Chemical Engineering Journal 520 (2025) 166147

论文核心总结

本研究针对嗜黑盐单胞菌（Halomonas nigrificans）X339 缺乏高效遗传操作工具的问题，首次开发了基于其内源 I-E 型 CRISPR-Cas 系统的单质粒基因编辑工具，实现了该菌株的精准基因敲除与代谢工程改造。通过敲除丙酸分解代谢关键基因prpC，大幅提升了丙酸向 3 - 羟基戊酸（3HV）单体的转化效率；进一步敲除 23.6 kb 的胞外多糖（EPS）合成基因簇PS1，重定向碳通量至聚羟基烷酸酯（PHA）合成，同时恢复了菌株的丙酸耐受性。最终获得的双突变株 ΔPS1ΔprpC实现了 100% 的丙酸向 3HV 转化率，同时维持了高细胞生物量与聚 (3 - 羟基丁酸酯 - co-3 - 羟基戊酸酯)（PHBV）合成效率，为该菌株作为工业化低成本生产生物可降解塑料的底盘细胞奠定了核心基础。

1. 论文摘要

嗜黑盐单胞菌 X339 是一株可利用广谱碳源合成聚羟基烷酸酯（PHAs）的多功能嗜盐细菌。本研究对该菌株进行基因工程改造，以增强其丙酸同化能力、提升 PHBV 产量。研究首先为该菌株构建了专属的内源 CRISPR-Cas 基因编辑工具，实现了精准的遗传修饰；利用该工具成功敲除了参与丙酸分解代谢、编码 2 - 甲基柠檬酸合酶的prpC基因，所得 ΔprpC突变株在添加 1 g/L 丙酸的培养体系中，丙酸向 3HV 的转化率从 1.8% 提升至 70.5%，PHBV 中的 3HV 摩尔分数从 0.28% 提升至 9.76%；但该修饰同时削弱了菌株的丙酸耐受性，使其细胞干重（CDW）从 15.05 g/L 降至 8.26 g/L，PHBV 含量从 51.60% 降至 29.67%。为解决这一问题，研究在 ΔprpC菌株中进一步敲除了 23.6 kb 的胞外多糖（EPS）合成基因簇PS1，限制碳通量流向 EPS 合成。该敲除意外地部分恢复了菌株的丙酸耐受性，最终获得的双突变株 ΔPS1ΔprpC细胞干重可达 12.91 g/L，PHBV 含量达 62.5%，3HV 摩尔分数 7.57%，丙酸向 3HV 的转化率最高可达 100%。上述结果证实了内源 CRISPR-Cas 编辑工具在代谢通路优化中的应用价值，同时确立了嗜黑盐单胞菌 X339 作为高效 PHBV 生产底盘菌株的潜力。

2. 论文关键词

基于CRISPR-Cas的基因编辑、遗传操作、盐单胞菌、聚羟基烷酸酯、胞外多糖

3. 研究目的

为非模式嗜盐菌Halomonas nigrificans X339 开发一套高效、简便的基因编辑工具，解决该菌株现有遗传操作体系复杂、效率低的技术瓶颈；

通过代谢工程改造阻断丙酸的无效分解代谢，提升丙酸向 PHBV 中 3HV 单体的转化效率，优化 PHBV 的材料性能；

解决prpC基因敲除后菌株丙酸耐受性下降、生物量与 PHBV 产量降低的核心矛盾，获得兼具高 3HV 转化率、高生物量、高 PHBV 产量的工程菌株；

验证Halomonas nigrificans X339 作为下一代工业生物技术底盘细胞，在低成本、非无菌条件下生产生物可降解塑料的应用潜力。

4. 研究思路

第一步：前期基础验证。测定Halomonas nigrificans X339 的抗生素敏感性，筛选可用于转化筛选的有效抗生素；验证接合转化与电转化两种方法在该菌株中的可行性，建立稳定的质粒转化体系。

第二步：内源 CRISPR-Cas 编辑工具构建。解析菌株基因组中内源 I-E 型 CRISPR-Cas 系统的基因组成、CRISPR 阵列结构，通过序列比对确定其识别的 PAM 序列；构建含 mini-CRISPR 表达模块、同源重组模板、sacB反向筛选质粒治愈模块的单质粒编辑系统，验证编辑效率与质粒治愈效率。第三步：单基因敲除与表型验证。利用构建的编辑工具敲除丙酸 2 - 甲基柠檬酸分解途径的关键基因prpC，验证敲除对丙酸向 3HV 转化效率的影响，同时测定菌株丙酸耐受性、生物量、PHBV 合成能力的变化，明确改造的优势与缺陷。第四步：双基因簇敲除与性能优化。针对prpC敲除株丙酸耐受性下降的问题，敲除 23.6 kb 的 EPS 合成基因簇PS1，阻断碳源向胞外多糖的无效分流，测定双突变株的生长、丙酸耐受性、PHBV 合成与丙酸利用效率，筛选最优工程菌株。第五步：机制解析与材料表征。通过转录组测序分析PS1敲除恢复菌株丙酸耐受性的分子机制；对工程菌株合成的 PHBV 进行提取与全面的理化性质表征，验证其工业应用价值。

第六步：结果总结与结论提炼。整合所有实验数据，明确内源 CRISPR-Cas 编辑工具的有效性，以及工程菌株的工业化应用潜力。

5. 研究亮点

工具创新：首次在盐单胞菌属中开发并应用基于内源 I-E 型 CRISPR-Cas 系统的基因编辑工具，仅需单个质粒即可完成精准基因敲除与长片段 DNA 删除，操作流程简便，结合sacB反向筛选模块可实现 100% 的质粒治愈效率，大幅简化了该菌株的遗传操作流程。

代谢改造创新：采用 “两步精准代谢调控” 策略，先通过敲除prpC阻断丙酸分解代谢，将丙酸向 3HV 的转化率从 1.8% 提升至 70.5%；再通过敲除PS1重定向碳通量，不仅将 PHBV 含量从野生型的 51.60% 提升至 62.5%，还实现了 100% 的丙酸向 3HV 转化率，同时大幅恢复了菌株的丙酸耐受性与生物量，解决了 “转化率提升与生长受限” 的核心矛盾。

菌株性能突破：最终获得的 ΔPS1ΔprpC双突变株，在 1 g/L 丙酸添加条件下，综合性能显著优于已报道的同类工程菌株，同时保留了嗜盐、耐碱、可利用广谱碳源的特性，适配工业化非无菌发酵的需求，可大幅降低 PHBV 的生产成本。

机制解析创新：通过转录组分析揭示了PS1敲除恢复丙酸耐受性的分子机制，即碳通量重定向后，菌株上调了 PHA 合成与外膜合成相关基因的表达，通过强化细胞壁结构抵御丙酸的毒性作用，为盐单胞菌的抗逆性改造提供了新的思路。

6. 可延伸研究方向

基因编辑工具的拓展优化：基于该内源 I-E 型 CRISPR-Cas 系统，开发基因敲入、转录激活 / 抑制等多功能遗传操作工具，同时将该编辑体系拓展至其他盐单胞菌菌株，构建盐单胞菌属通用的内源 CRISPR 编辑平台。

代谢通路的深度优化：过表达 PHBV 合成的关键基因phaA、phaB、phaC，进一步强化前体供给；敲除其他副产物合成通路，最大化碳通量向 PHBV 的分流；通过精准调控实现 3HV 摩尔分数的可控调节，定制不同性能的 PHBV 产品。

低成本底物的适配改造：针对木质纤维素水解液、餐厨废弃物、工业有机废水等廉价碳源，优化菌株的底物利用能力，实现废弃资源的高值化转化，进一步降低 PHBV 的生产成本。

底盘细胞的多用途开发：以改造后的Halomonas nigrificans X339 为底盘，拓展其合成能力，实现 PHBV 与四氢嘧啶、赖氨酸、3 - 羟基丙酸等高附加值化学品的联产，提升发酵过程的综合经济效益。

工业化放大与工艺优化：开展规模化发酵罐中试实验，优化发酵温度、pH、底物补料策略等工艺参数，建立稳定的工业化 PHBV 生产工艺，推动菌株的产业化应用。

7. 测量数据、研究意义及对应图表

抗生素敏感性数据：测定了Halomonas nigrificans X339 对 7 种常用抗生素的敏感性与最低抑菌浓度（MIC），筛选出可用于菌株转化筛选的有效抗生素，为后续遗传操作体系的建立提供了核心筛选标记依据，数据来自Fig. S1。

菌株转化效率数据：验证了接合转化与电转化两种方法在Halomonas nigrificans X339 中的可行性，测定了转化效率，建立了稳定的质粒转化体系，为基因编辑质粒的导入提供了技术支撑，数据来自Fig. 2。

内源 CRISPR-Cas 系统结构与 PAM 序列数据：解析了菌株内源 I-E 型 CRISPR-Cas 系统的 cas 基因组成、CRISPR 阵列特征，确定了该系统识别的 5'-AAG-3' PAM 序列，为基因编辑工具的设计提供了核心分子基础，数据来自Fig. 3。

prpC基因敲除验证数据：通过菌落 PCR 验证了prpC基因的成功敲除，同时测定了sacB介导的质粒治愈效率，证实了构建的内源 CRISPR-Cas 编辑工具的有效性，数据来自Fig. S2。

丙酸耐受性生长数据：测定了野生型 X339 与 ΔprpC突变株在 0~10 g/L 丙酸浓度下的生长曲线，明确了prpC基因敲除会导致菌株丙酸耐受性显著下降，为后续二次改造提供了明确的表型依据，数据来自Fig. 4B、Fig. 4C。

EPS 合成基因簇PS1敲除验证数据：通过菌落 PCR 验证了 23.6 kb 的PS1基因簇的成功敲除，观察到敲除株菌落形态的变化，证实了编辑工具可实现长片段 DNA 的高效敲除，数据来自Fig. 5A、Fig. S3。

菌株发酵性能核心数据：在添加 1 g/L 丙酸的发酵体系中，测定了野生型 X339、ΔprpC、ΔPS1、ΔPS1ΔprpC四株菌的生长曲线、细胞干重、PHBV 浓度 / 含量、3HV 摩尔分数、丙酸消耗量、丙酸向 3HV 转化率，全面量化了不同基因改造对菌株 PHBV 合成性能的影响，筛选出了综合性能最优的工程菌株，数据来自Fig. 6A~Fig. 6G。

转录组差异表达数据：对 ΔprpC与 ΔPS1ΔprpC菌株进行转录组测序，分析了差异表达基因，解析了PS1基因簇敲除恢复菌株丙酸耐受性的分子机制，为菌株的进一步优化提供了理论依据，数据来自Fig. S4。

PHBV 材料理化性质数据：对 ΔPS1ΔprpC菌株合成的 PHBV 进行了全面表征，测定了其 FTIR、¹H NMR、TGA、DSC、GPC 数据，明确了该 PHBV 的化学结构、热稳定性、结晶性能、分子量分布等核心材料特性，验证了其工业应用价值，数据来自Fig. 7A~Fig. 7F。

8. 核心研究结论

本研究成功开发了一套基于Halomonas nigrificans X339 内源 I-E 型 CRISPR-Cas 系统的单质粒基因编辑工具，该工具可实现该菌株的精准基因敲除与长片段 DNA 删除，结合sacB反向筛选模块可实现 100% 的质粒治愈效率，是盐单胞菌属中首次成功应用的内源 CRISPR-Cas 编辑系统，大幅丰富了该菌属的遗传操作工具箱。

敲除丙酸 2 - 甲基柠檬酸分解途径的关键基因prpC，可完全阻断丙酸的分解代谢，使丙酸向 3HV 的转化率从野生型的 1.8% 提升至 70.5%，PHBV 中 3HV 摩尔分数从 0.28% 提升至 9.76%；但该改造会导致菌株丙酸耐受性显著下降，细胞干重从 15.05 g/L 降至 8.26 g/L，PHBV 含量从 51.60% 降至 29.67%。

在 ΔprpC菌株中进一步敲除 23.6 kb 的 EPS 合成基因簇PS1，可有效重定向碳通量，减少碳源向胞外多糖的无效分流，不仅部分恢复了菌株的丙酸耐受性，还大幅提升了 PHBV 合成效率；最终获得的 ΔPS1ΔprpC双突变株，细胞干重可达 12.91 g/L，PHBV 含量 62.5%，3HV 摩尔分数 7.57%，丙酸向 3HV 的转化率达到 100%，综合性能显著优于同类工程菌株。

转录组分析表明，PS1基因簇的敲除可上调 PHA 合成、细胞壁合成相关基因的表达，通过强化外膜结构抵御丙酸的毒性作用，是菌株丙酸耐受性恢复的核心机制。

ΔPS1ΔprpC菌株合成的 PHBV 具备良好的热稳定性、适宜的分子量分布与加工性能，可满足包装、生物医用等领域的应用要求；本研究证实了Halomonas nigrificans X339 可通过内源 CRISPR-Cas 编辑系统实现高效代谢优化，是下一代工业生物技术中极具潜力的底盘菌株。

9. 芬兰 Bioscreen 仪器测量的微生物生长曲线数据详细解读

（1）数据来源与测量基础信息

测量仪器：芬兰 Bioscreen C 全自动微生物生长曲线分析仪

数据对应图表：Fig. 4B、Fig. 4C、Fig. 6A

测量体系与参数：

丙酸耐受性测试（Fig. 4B、Fig. 4C）：采用 LB30 液体培养基，设置 0、0.5、1、2、3、5、10 g/L 共 7 个丙酸浓度梯度，37℃振荡培养 72 h，每 30 min 自动测定一次 OD600 值，每个处理设置 4 个生物学重复；

发酵体系生长测试（Fig. 6A）：采用添加 1 g/L 丙酸的 30MMG 发酵培养基，37℃振荡培养 48 h，每 30 min 自动测定一次 OD600 值，每个菌株设置 8 个生物学重复。

（2）核心数据解读

Fig. 4B（野生型 X339 菌株）：生长曲线显示，当培养基中丙酸浓度≤5 g/L 时，菌株的生长速率、最大 OD600 值与无丙酸对照组无显著差异；仅当丙酸浓度达到 10 g/L 时，菌株指数期的生长速率出现小幅下降，稳定期的生物量略有降低。该数据直接证实了野生型Halomonas nigrificans X339 具备优异的丙酸耐受性，可在高浓度丙酸环境下正常生长。

Fig. 4C（ΔprpC突变株）：生长曲线显示，当丙酸浓度≥2 g/L 时，菌株的生长即出现显著抑制，表现为指数期生长速率大幅下降、稳定期最大 OD600 值显著降低；且丙酸浓度越高，生长抑制效应越强。该数据直接量化了prpC基因敲除对菌株丙酸耐受性的负面影响，证实了 2 - 甲基柠檬酸途径是该菌株分解代谢丙酸、解除丙酸毒性的核心通路。

Fig. 6A（发酵体系四株菌生长对比）：生长曲线显示，野生型 X339 与 ΔPS1单敲除株的生长趋势、最大生物量几乎完全一致，证实PS1基因簇的敲除不会影响菌株在发酵体系中的正常生长；ΔprpC单敲除株的生长受到严重抑制，生物量显著低于野生型；而 ΔPS1ΔprpC双突变株的生长情况显著优于 ΔprpC单敲除株，仅略低于野生型，直接证实了PS1基因簇的敲除可有效恢复prpC敲除株的丙酸耐受性与生长能力。

（3）该数据的核心研究意义

为基因编辑的表型效应提供了精准的定量证据：Bioscreen 仪器的高通量、全自动、连续监测特性，避免了人工取样测量的误差，精准量化了不同基因改造对菌株在丙酸胁迫下生长性能的影响，为 “prpC敲除导致丙酸耐受性下降、PS1敲除恢复耐受性” 的核心结论提供了直接、可重复的定量数据支撑。

明确了菌株的发酵工艺适配范围：通过不同丙酸浓度下的生长曲线，确定了野生型与工程菌株的丙酸耐受阈值，为后续工业化发酵过程中丙酸的补加浓度、补料策略提供了关键的工艺参数依据，避免因丙酸浓度过高导致菌株生长受限。

验证了代谢改造策略的合理性：生长曲线直接反映了菌株的碳通量分配情况，PS1基因簇的敲除减少了碳源向 EPS 合成的无效消耗，使菌株可将更多的碳源与能量用于细胞生长与应对丙酸毒性，从生长表型上验证了 “两步代谢调控” 策略的科学性与有效性。

实现了工程菌株的高效初筛：通过 Bioscreen 仪器的高通量检测能力，可同时完成多株突变株的生长性能评估，快速筛选出生长性能与 PHBV 合成能力平衡的最优工程菌株，大幅缩短了代谢工程改造的筛选周期。

为菌株的工业化应用提供了基础数据：发酵体系中的生长曲线明确了工程菌株的生长周期、对数期与稳定期的时间节点，为工业化放大过程中的种子培养时间、发酵周期、底物补料时机的确定提供了核心的基础数据支撑。