Cold stress enhances cryotolerance in Lacticaseibacillus rhamnosus B6 via membrane lipid remodeling and differential protein expression
冷胁迫通过膜脂重塑和差异蛋白表达增强鼠李糖乳杆菌B6的抗冻性
来源:Current Research in Microbial Sciences 9 (2025) 100453
1.论文摘要总结
解析乳酸菌抗冻性的分子机制，对食品加工中保持菌株活力至关重要。本研究以表型特性不同的两株鼠李糖乳杆菌B6和KF7为研究对象，在液氮冷冻前对菌株进行4℃、2h的冷胁迫预处理。结果显示，经冷胁迫处理的B6菌株冷冻后存活率（53%）显著高于KF7菌株（30%）和未处理对照组（44%vs10%，p<0.05），扫描电镜下几乎观察不到细胞破裂。冷胁迫通过提升菌株膜中不饱和脂肪酸（UFA）含量，使UFA与饱和脂肪酸（SFA）的比值从1.36升高至1.62（p<0.05），改变了B6菌株的细胞膜流动性。与未处理组相比，冷胁迫处理的B6菌株中有219个蛋白显著上调，主要参与脂肪酸生物合成、翻译和转运过程。值得注意的是，B6菌株的荚膜结构可能是其高抗冻性的重要原因。本研究揭示了鼠李糖乳杆菌B6的双重抗冻机制，即细胞膜动态脂质组重塑与协同的蛋白表达调控，强调了鼠李糖乳杆菌菌株的细胞表面特征和冷胁迫处理，在制备深冷冻直投式发酵剂和高活力益生菌产品中的重要价值。
2.论文关键词（中文）
鼠李糖乳杆菌、冷胁迫、脂肪酸、抗冻性、蛋白质组学
3.研究目的
1.核心目的：揭示鼠李糖乳杆菌应对低温冷冻的抗冻分子机制，明确冷胁迫预处理提升菌株冷冻后存活率的核心调控通路。
2.对比分析两株表型不同的鼠李糖乳杆菌B6和KF7的抗冻性差异，解析菌株间抗冻能力分化的关键结构与分子基础。
3.系统解析冷胁迫下菌株细胞膜脂肪酸组成的重塑规律，以及蛋白表达谱的变化特征，构建鼠李糖乳杆菌冷适应的调控网络。
4.应用目标：为食品工业中制备高细胞活力的益生菌制剂、直投式发酵剂提供菌株筛选标准和冷胁迫预处理的实用工艺方案。
4.研究思路
1.菌株活化与生长特性分析：活化鼠李糖乳杆菌B6和KF7菌株，利用BioscreenC全自动微生物生长曲线分析仪测定两株菌在37℃下的生长曲线，明确其生长周期，确定对数生长期（OD600=0.8）为后续冷胁迫处理的取样阶段。
2.冷胁迫处理与抗冻性表型验证：将两株菌培养至对数生长期后，分别在30℃（对照）和4℃（冷胁迫）处理2h，随后置于液氮中冷冻24h；通过平板计数法计算冷冻前后的菌株存活率，初步验证冷胁迫对菌株抗冻性的提升效果。
3.细胞活力与完整性验证：采用cFDA/PI双染色流式细胞术，定量分析冷冻后菌株的活/死细胞比例；通过扫描电镜（SEM）观察冷冻后菌株的细胞形态、包膜破裂情况，通过透射电镜（TEM）观察两株菌的荚膜结构差异，解析菌株抗冻性差异的结构基础。
4.细胞膜脂质组重塑分析：以抗冻性优异的B6菌株为研究对象，通过GC-MS分析冷胁迫处理前后菌株细胞膜脂肪酸的组成变化，定量检测饱和脂肪酸（SFA）、不饱和脂肪酸（UFA）的含量及UFA/SFA比值变化，明确冷胁迫对细胞膜流动性的调控作用。
5.冷胁迫响应的蛋白质组学分析：通过LC-MS/MS对冷胁迫处理和对照组的B6菌株进行定量蛋白质组学分析，筛选差异表达蛋白（变化倍数>1.5）；通过KOG功能分类对差异蛋白进行功能富集，解析冷胁迫响应的核心代谢通路和关键功能蛋白。
6.抗冻机制整合与结论总结：结合表型、细胞膜脂质组和蛋白质组学结果，整合构建鼠李糖乳杆菌B6冷胁迫提升抗冻性的双重调控机制，明确菌株荚膜结构、膜脂重塑、蛋白表达调控在抗冻性中的核心作用，并提出后续研究方向。
5.研究亮点
1.首次揭示了鼠李糖乳杆菌的双重抗冻分子机制：系统阐明了“4℃冷胁迫预处理通过细胞膜动态脂质重塑+协同的蛋白表达调控”提升菌株抗冻性的核心通路，填补了鼠李糖乳杆菌这一重要工业菌株抗冻机制研究的空白。
2.发现了菌株荚膜结构是抗冻性差异的关键决定因素：通过电镜观察证实，鼠李糖乳杆菌B6的荚膜结构可显著降低冷冻过程中冰晶对细胞的损伤，是其相较于KF7菌株具有更优异抗冻性的重要结构基础，为高抗冻性益生菌菌株的筛选提供了新的表型标志物。
3.鉴定了冷胁迫响应的核心功能蛋白与调控靶点：通过定量蛋白质组学发现，冷胁迫可显著上调RecQ解旋酶（11.73倍）、乙酰辅酶A羧化酶（ACCase，3.4倍）、LysR家族转录调控因子（5.69倍）等关键蛋白，明确了脂肪酸合成、DNA/RNA损伤修复、转录翻译维持是菌株冷适应的核心生物学过程。
4.提供了可直接工业化应用的抗冻预处理方案：证实4℃、2h的冷胁迫预处理可使鼠李糖乳杆菌B6液氮冷冻后的存活率从44%提升至53%，使KF7菌株从10%提升至30%，为食品工业中益生菌冻干粉、深冷冻直投式发酵剂的生产提供了简单高效的工艺优化方案。
5.拓展了乳酸菌冷适应的理论认知：证实冷胁迫不仅调控细胞膜脂肪酸组成，还可通过双组分系统、ABC转运体、氨基酸代谢等多个通路协同提升菌株的低温适应性，完善了革兰氏阳性乳酸菌冷胁迫响应的调控网络。
6.可延伸的研究方向
1.构建荚膜/胞外多糖（EPS）合成关键基因的敲除突变体，通过回补实验验证荚膜结构在鼠李糖乳杆菌抗冻性中的直接作用，明确EPS合成与抗冻性的量效关系。
2.优化冷胁迫预处理的工艺参数（温度、处理时长、菌株生长阶段），结合外源抗冻保护剂，进一步提升菌株液氮冷冻、冷冻干燥及长期冷冻储存后的存活率。
3.探究该冷胁迫抗冻机制在植物乳杆菌、嗜热链球菌等其他工业乳酸菌中的保守性，开发适用于多菌种的通用型益生菌抗冻保护策略。
4.开展中试规模的直投式发酵剂、益生菌冻干粉生产试验，验证冷胁迫预处理在工业化生产中的应用效果，评估其对产品发酵性能、益生菌活力的影响。
5.深入解析冷胁迫响应的转录调控网络，明确LysR家族转录因子等关键调控蛋白的靶基因，构建鼠李糖乳杆菌冷适应的精准调控通路。
6.研究菌株在长期冷冻储存过程中的活力稳定性，解析冷胁迫预处理对菌株长期保藏后抗冻性、发酵性能的影响，优化产品的保藏方案。
7.结合转录组、代谢组与蛋白质组多组学联合分析，系统解析鼠李糖乳杆菌冷胁迫响应的多层次调控网络，挖掘更多抗冻相关的功能基因。
7.测量的数据及研究意义（对应图表/表格）
1.两株鼠李糖乳杆菌的生长曲线数据，来自Fig.1。
研究意义：明确了B6和KF7菌株在MRS培养基中的生长动力学特征，证实两株菌的延滞期、对数生长期、稳定期无显著差异，排除了菌株生长特性差异对后续抗冻性实验结果的干扰；同时确定了对数生长期中期（OD600=0.8）为冷胁迫处理的最佳取样阶段，为后续实验提供了标准化的取样依据。
2.液氮冷冻后菌株的存活率数据，来自Fig.2。
研究意义：定量证实了4℃冷胁迫预处理可显著提升两株菌液氮冷冻后的存活率，明确了B6菌株在有无冷胁迫处理下均具有远优于KF7菌株的抗冻性，直接验证了冷胁迫对乳酸菌抗冻性的提升效果，同时筛选出B6为后续机制解析的目标菌株。
3.冷冻后菌株活/死细胞比例的流式细胞术检测数据，来自Fig.3。
研究意义：通过cFDA/PI双染色法，从单细胞水平验证了冷胁迫对菌株冷冻后细胞活力的保护作用，与平板计数结果形成相互印证；排除了菌株进入活的非可培养状态（VBNC）对存活率结果的干扰，为冷胁迫提升菌株抗冻性提供了更直接的细胞学证据。
4.冷冻后菌株细胞形态的扫描电镜（SEM）观察与定量数据，来自Fig.4。
研究意义：直观呈现了冷冻对菌株细胞结构的损伤，证实冷胁迫可显著减少KF7菌株的细胞破裂、结构坍塌和胞质泄漏，而B6菌株在冷冻后仍能保持完整的细胞形态；从细胞结构层面揭示了两株菌抗冻性差异的原因，证实冷胁迫可通过保护细胞膜完整性提升菌株抗冻性。
5.冷胁迫处理前后菌株细胞膜脂肪酸组成的定量数据，来自Table1。
研究意义：明确了冷胁迫对B6菌株细胞膜脂肪酸组成的调控规律，证实冷胁迫可显著降低膜中饱和脂肪酸含量、提升不饱和脂肪酸含量，使UFA/SFA比值从1.36升高至1.62；从脂质组层面揭示了冷胁迫通过提升细胞膜流动性，减少冷冻过程中冰晶对膜的损伤，是菌株抗冻性提升的核心机制之一。
6.冷胁迫响应差异表达蛋白的KOG功能分类数据，来自Fig.5。
研究意义：对325个差异表达蛋白进行了功能分类，明确了冷胁迫主要上调了脂肪酸转运与代谢、氨基酸转运与代谢、转录翻译、细胞壁/膜生物发生、物质转运等相关通路的蛋白表达；从蛋白质组层面系统解析了菌株冷胁迫响应的核心生物学过程，为抗冻机制的解析提供了组学层面的支撑。
7.冷胁迫下显著上调的关键功能蛋白列表，来自Table2。
研究意义：鉴定了冷胁迫响应的核心功能蛋白，包括DNA/RNA损伤修复相关蛋白（RecQ、UvrA/UvrC）、脂肪酸合成相关蛋白（ACCase、长链脂肪酸-CoA连接酶）、转录翻译相关蛋白（rpoD、rpoB、核糖体蛋白）、转运相关蛋白（ABC转运体）等；明确了这些蛋白在菌株冷适应中的潜在作用，为后续功能基因验证提供了核心靶点。
8.两株菌的细胞超微结构透射电镜（TEM）观察数据，来自Fig.6。
研究意义：直观证实了B6菌株具有明显的荚膜结构，而KF7菌株缺乏该结构；从细胞超微结构层面揭示了两株菌抗冻性差异的关键结构基础，提出荚膜的冷冻保护作用是B6菌株高抗冻性的重要原因，为高抗冻性菌株的筛选提供了新的方向。
8.研究结论
1.4℃、2h的冷胁迫预处理可显著提升鼠李糖乳杆菌液氮冷冻后的存活率，其中B6菌株冷冻后存活率从44%提升至53%，KF7菌株从10%提升至30%；且B6菌株的天然抗冻性显著优于KF7菌株，是更具工业应用潜力的益生菌/发酵剂菌株。
2.冷胁迫可通过动态重塑细胞膜脂肪酸组成提升菌株抗冻性：冷胁迫使B6菌株细胞膜中饱和脂肪酸含量显著下降，不饱和脂肪酸含量显著上升，UFA/SFA比值从1.36升高至1.62，有效提升了细胞膜的流动性，减少了冷冻过程中冰晶对细胞膜的损伤。
3.冷胁迫可显著调控菌株的蛋白表达谱：冷胁迫处理后，B6菌株中有325个蛋白发生差异表达，其中219个蛋白显著上调；这些上调蛋白主要参与脂肪酸生物合成、DNA/RNA损伤修复、转录翻译维持、物质转运、双组分信号系统等生物学过程，通过多通路协同作用提升菌株的低温适应性和冷冻存活率。
4.鼠李糖乳杆菌B6主要通过双重策略实现抗冻性提升：一是通过脂肪酸代谢相关蛋白的差异表达，调控细胞膜脂质组成重塑，提升膜流动性；二是通过上调核酸修复、转录翻译相关蛋白，维持低温下细胞的正常生理功能，修复低温造成的细胞损伤。
5.菌株的细胞表面特征是抗冻性的重要决定因素：B6菌株的荚膜结构可发挥显著的冷冻保护作用，减少冰晶形成和对细胞的机械损伤，是其相较于KF7菌株具有更优异抗冻性的关键结构基础。
9.芬兰Bioscreen仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究使用芬兰OyGrowthCurvesAbLtd公司生产的BioscreenC全自动微生物生长曲线分析仪，测定了鼠李糖乳杆菌B6和KF7菌株在37℃下24h内的生长曲线，每1小时记录一次OD600值，获得了两株菌完整的生长动力学数据。这些生长曲线数据的核心研究意义分为以下6个维度：
1.为后续实验确定了标准化的取样时间点
生长曲线数据明确了两株菌的生长周期：0-2h为延滞期，2-12h为对数生长期，12h后进入稳定期。基于此，研究确定了对数生长期中期（OD600=0.8）为冷胁迫处理的取样阶段，确保了冷胁迫处理时菌株处于生理状态一致的活跃生长期，排除了菌株生长阶段不同对后续抗冻性、脂肪酸组成、蛋白质组学实验结果的干扰，保障了整个研究实验体系的标准化和结果的可靠性。
2.排除了菌株生长特性差异对抗冻性表型的干扰
生长曲线数据证实，B6和KF7两株菌在MRS培养基中的生长动力学特征高度一致，延滞期、对数生长速率、最大生物量均无显著差异。这一结果直接排除了“两株菌抗冻性的差异是由生长繁殖能力不同导致”的可能性，证实了B6菌株更优异的抗冻性来源于其自身的细胞结构特征和冷适应调控机制，而非基础生长特性的差异，为后续抗冻机制的解析奠定了坚实的逻辑基础。
3.为菌株的工业化应用提供了基础生长工艺参数
BioscreenC仪器获得的高精度生长曲线数据，明确了菌株的最适培养时间、对数生长期时长、稳定期起始时间等关键工艺参数。这些数据可直接用于指导该菌株在工业化生产中的发酵培养工艺优化，包括发酵周期设定、接种量控制、菌体收获时间节点的选择，为该菌株作为益生菌、发酵剂的规模化生产提供了基础的工艺数据支撑。
4.保障了多组学实验样本的生理同质性
本研究的蛋白质组学分析需要菌株处于生理状态均一的生长阶段，生长曲线数据精准界定了菌株的对数生长期，确保了冷胁迫处理组和对照组的取样均处于同一生长阶段，避免了因取样时间偏差导致的菌株生理状态差异，保障了蛋白质组学检测到的差异表达蛋白确实是由冷胁迫处理引起，而非生长阶段不同导致，提升了组学数据的准确性和生物学意义。
5.实现了菌株生长的高通量、自动化精准监测
BioscreenC仪器可同时完成多株菌、多重复样本的全自动生长监测，本研究中两株菌的生长曲线均设置了多生物学重复，所有样本在完全一致的温度、振荡条件下同步培养与检测，彻底消除了批次间培养条件差异带来的实验误差。多重复的连续生长数据也为统计分析提供了充足的样本量，保障了两株菌生长特性比较结果的统计学显著性。
6.为菌株的表型特性研究提供了基础数据支撑
本研究中B6和KF7菌株的胞外多糖合成、免疫调节活性等表型已有前期研究基础，本次测定的生长曲线数据，补充了两株菌的基础生长特性信息，完善了菌株的表型特征谱。同时，生长曲线数据也为后续研究两株菌的抗逆性、发酵性能、益生特性等提供了基础的生长特性参考，拓展了菌株的应用研究基础。