Programmable adenine deamination in bacteria using a Cas9–adenine-deaminase fusion
利用 Cas9 - 腺嘌呤脱氨酶融合蛋白在细菌中实现可编程的腺嘌呤脱氨基编辑
来源：Chem. Sci., 2020, 11, 1657
1. 论文摘要
精准的遗传操作对细菌生理学研究至关重要，但部分细菌因内源同源重组（HR）能力弱、缺乏兼容的外源 HR 系统，难以实现精准基因组编辑。本研究报道了一种利用 Cas9 切口酶与腺嘌呤脱氨酶融合蛋白，在细菌基因组中直接实现腺嘌呤（A）到鸟嘌呤（G）精准转换的快速高效编辑方法。该方法通过酶促脱氨基反应和后续的 DNA 复制过程实现碱基替换，而非传统细菌遗传操作依赖的同源重组，大幅简化了基因组编辑流程。本研究针对金黄色葡萄球菌中 staphylopine / 金属复合物转运蛋白编码基因 cntBC 的所有可编辑腺嘌呤位点进行了系统筛选，精准定位了调控金属离子输入的关键氨基酸残基，证明该系统将极大推动细菌基因组工程研究的发展。
2. 论文关键词
可编程腺嘌呤脱氨基、Cas9 - 腺嘌呤脱氨酶融合蛋白、细菌基因组编辑、腺嘌呤碱基编辑器（ABE）、CRISPR-Cas9、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌
3. 研究目的
① 破解部分细菌因内源同源重组能力弱、缺乏兼容的外源 HR 系统，导致精准遗传操作难以实现的核心瓶颈，开发不依赖同源重组的细菌新型基因组编辑技术。
② 在革兰氏阴性的大肠杆菌和革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌中，构建并验证高效、稳健的细菌腺嘌呤碱基编辑系统 pABE，实现基因组中 A 到 G 的精准单碱基替换。③ 系统表征 pABE 系统的编辑效率、可编辑窗口、多重编辑能力、编辑保真度与全基因组脱靶效应，明确其技术参数与应用边界。④ 开发基于 pABE 系统的细菌蛋白功能残基高通量筛选方法，实现对靶基因可编辑位点的规模化突变与功能筛选，为细菌功能基因组学研究提供高效新工具。
⑤ 为其他难编辑细菌中腺嘌呤碱基编辑系统的开发提供设计参考与技术范式，推动细菌基因组工程与合成生物学的发展。
4. 研究思路
① pABE 编辑系统的构建：设计并构建双宿主型编辑质粒 pABE，该质粒搭载 ColE1 和 repF 双复制起点，可在大肠杆菌和金黄色葡萄球菌中稳定复制；同时插入 spCas9 (D10A) 切口酶与进化型腺嘌呤脱氨酶 ABE7.10 的融合蛋白表达盒，以及 sgRNA 靶向表达盒，完成编辑系统的核心载体构建。
② 系统编辑效率与靶向范围的验证：在金黄色葡萄球菌实验室菌株 RN4220、临床分离菌株 Newman 和 N315 中，测试 pABE 系统对不同靶基因的 A 到 G 编辑效率；系统设计覆盖 sgRNA 靶序列 2~10 位腺嘌呤位点的靶向序列，明确该系统在细菌中的可编辑窗口。③ 大肠杆菌中编辑能力的验证与定量：在大肠杆菌 MG1655 和 DH5α 菌株中测试 pABE 的编辑效率；构建 lacZ 报告基因体系，先通过胞嘧啶碱基编辑器（CBE）使 lacZ 基因失活，再用 pABE 系统修复终止密码子，通过蓝白斑表型实验和测序定量评估系统的编辑效率。④ 系统多重编辑能力与保真度评估：在单一 pABE 质粒中组装双 sgRNA 表达盒，测试双基因同时编辑的能力；通过靶位点深度测序，检测非预期的碱基突变频率；对编辑后的菌株进行全基因组测序，评估系统的全基因组脱靶效应。⑤ 系统的应用验证：功能残基高通量筛选：以金黄色葡萄球菌 staphylopine / 金属复合物转运蛋白 CntBC 为研究对象，针对 cntBC 基因的所有可编辑腺嘌呤位点，构建 38 个靶向 pABE 质粒，获得 42 个单氨基酸突变菌株；通过生长表型分析，筛选调控 CntBC 转运功能的关键残基。⑥ 关键残基的功能验证与机制解析：利用传统同源重组编辑系统 pCasSA、pKOR1 构建关键残基的定点突变菌株，通过生长曲线验证表型一致性；通过 ICP-OES 测定菌株胞内钴离子含量，从生化层面验证残基功能；通过蛋白结构建模，解析关键残基的作用分子机制。
⑦ 结果整合与结论总结：整合系统构建、效率验证、保真度评估、应用筛选的全流程实验结果，总结 pABE 系统的核心优势与应用价值，提出后续系统优化与拓展方向。
5. 研究亮点
① 首次在革兰氏阴性大肠杆菌和革兰氏阳性金黄色葡萄球菌中，成功建立了高效的细菌腺嘌呤碱基编辑系统 pABE，突破了传统细菌基因编辑对同源重组的绝对依赖，无需外源修复模板即可实现精准的 A 到 G 单碱基替换，大幅简化了细菌基因组编辑的操作流程，解决了难编辑细菌的遗传操作瓶颈。
② 系统明确了 pABE 系统在细菌中的可编辑窗口为 sgRNA 靶序列的 4~8 位，单靶点编辑效率最高可达 100%，同时实现了双基因的同步高效编辑，具备多重基因组编辑能力，拓展了系统的应用场景。③ 证实了 pABE 系统具有极高的编辑保真度与安全性，深度测序结果显示靶位点非预期的 A 到 T/C 突变可忽略不计，全基因组测序未检测到任何脱靶编辑事件，解决了 CRISPR 编辑在细菌中应用的脱靶顾虑。④ 首创了基于腺嘌呤碱基编辑的细菌蛋白功能残基高通量筛选方法，无需构建大量同源重组模板，即可快速完成靶基因可编辑位点的规模化单碱基突变，成功从 42 个突变体中筛选出金黄色葡萄球菌 CntBC 转运蛋白的 4 个关键功能残基，为细菌基因功能研究提供了高效、便捷的全新技术范式。
⑤ 构建的 pABE 系统具备双复制起点，可同时适配大肠杆菌和金黄色葡萄球菌两种模式菌，突破了单一宿主的限制，为其他革兰氏阳性、阴性菌中腺嘌呤碱基编辑系统的开发提供了核心设计参考与技术基础。
6. 可延伸的方向
① 系统靶向范围的拓展：结合 PAM 拓展型 Cas9 核酸酶（如 xCas9、Cas9-NG 等）对 pABE 系统进行改造，突破 spCas9 对 NGG PAM 的限制，大幅扩大系统的基因组靶向范围，实现对细菌基因组中更多位点的精准编辑。
② 适用菌种的广谱化拓展：基于 pABE 系统的设计思路，在结核分枝杆菌、链霉菌、乳酸菌等同源重组能力弱的难编辑细菌中，开发适配的腺嘌呤碱基编辑系统，将单碱基编辑技术拓展至更多工业与临床相关细菌中。③ 系统编辑性能的优化：通过蛋白工程改造腺嘌呤脱氨酶、Cas9 切口酶与 linker 序列，进一步提升编辑效率，缩小可编辑窗口，降低潜在的旁编辑效应，实现细菌基因组中更精准的单碱基定点编辑。④ 全基因组规模遗传筛选体系的构建：结合高通量寡核苷酸合成技术，构建基于 pABE 系统的细菌全基因组单碱基编辑筛选文库，实现对细菌生长、毒力、耐药、代谢相关关键基因与功能残基的全基因组规模化鉴定。⑤ 多类型编辑系统的联用：将 pABE 腺嘌呤碱基编辑系统与胞嘧啶碱基编辑系统（CBE）联用，在细菌中实现 A→G 和 C→T 两种碱基的同步编辑，拓展细菌基因组编辑的灵活性，为细菌代谢工程与合成生物学改造提供更强大的工具。
⑥ 工业与临床场景的落地应用：利用 pABE 系统对工业微生物菌株进行代谢工程改造，优化目标产物的合成通路，提升发酵效率；针对临床耐药致病菌，开发基于该系统的毒力因子失活、耐药基因逆转的新策略，拓展其在抗感染领域的应用。
7. 测量的数据、对应图表及研究意义
① pABE 系统的载体结构、编辑原理及金黄色葡萄球菌中的基础编辑效率数据
数据内容：pABE 编辑质粒的元件构成图谱；Cas9 - 腺嘌呤脱氨酶碱基编辑的分子机制模型；腺嘌呤脱氨基的化学反应原理；哺乳动物 ABE 的可编辑窗口；金黄色葡萄球菌 RN4220 菌株中 agrA、murR 基因靶位点的 A 到 G 编辑效率。
数据来源：Fig 1 pABE enabled highly efficient adenine to guanine conversion in S. aureus. (A) Map of the adenine base editing system pABE; (B) A schematic model for Cas9–adenine deaminase base editor; (C) The adenine deamination reaction catalyzed by an adenine deaminase; (D) The editable window of a mammalian adenine base editor; (E) Highly efficient conversions of adenine to guanine by pABE in the S. aureus RN4220 strain.
研究意义：完成了细菌腺嘌呤碱基编辑系统 pABE 的设计与构建，阐明了其编辑的分子机制，首次证实该系统在金黄色葡萄球菌中可实现高效的 A 到 G 精准碱基替换，为后续系统的优化与应用奠定了核心基础。
② pABE 系统在大肠杆菌中的编辑效率与定量验证数据
数据内容：大肠杆菌 MG1655、DH5α 菌株中靶基因位点的 A 到 G 编辑效率；lacZ 报告基因系统的编辑原理；蓝白斑表型实验的编辑效率统计、测序定量的碱基转换效率。
数据来源：Fig 2 pABE enabled highly efficient adenine to guanine conversion in E. coli. (A) Highly efficient conversions of adenine to guanine by pABE in the E. coli MG1655 and DH5a strains; (B) The reporter gene lacZ was first inactivated by installing a premature stop codon using a cytosine base editor (CBE) and then mutated back to the active form by pABE to evaluate its adenine editing efficiency; (C) Highly efficient editing of the lacZ gene was achieved using the pABE system, confirmed by both the phenotypical assay and the sequencing result.
研究意义：证实了 pABE 系统在革兰氏阴性菌大肠杆菌中同样具备高效的编辑能力，通过 lacZ 报告系统实现了编辑效率的精准定量，证明该系统可同时适配革兰氏阳性与阴性菌，具备良好的宿主普适性。
③ 基于 pABE 系统的 CntBC 功能残基筛选的实验设计与突变体生长表型数据
数据内容：金黄色葡萄球菌 StP / 金属离子获取通路的作用机制；针对 cntBC 基因构建的 38 个靶向质粒与 42 个单氨基酸突变菌株的信息；3 mM Co²+ 胁迫下 15 株 cntC 突变体、27 株 cntB 突变体的生长表型热图。
数据来源：Fig 3 A pABE-based screening identified key residues for CntBC-mediated metal acquisition. (A) Scheme of the processes for StP/metal acquisition in S. aureus; (B) Thirty-eight plasmids targeting 42 sites of cntBC were constructed and transformed into S. aureus to screen key functional residues of CntBC; (C) Heat map of the growth of the 15 cntC-mutant strains in the presence of 3 mM Co²+; (D) Heat map of the growth of the 27 cntB-mutant strains in the presence of 3 mM Co²+.
研究意义：建立了基于 pABE 系统的细菌蛋白功能残基高通量筛选方法，通过规模化单碱基突变快速筛选出 4 个可显著缓解高浓度钴离子毒性的 CntBC 突变体，初步定位了调控金属转运的关键残基，直接证明了该系统在细菌功能基因组学研究中的应用价值。
④ CntBC 关键残基的功能验证与结构解析数据
数据内容：2 mM Co²+ 胁迫下，4 个关键残基定点突变菌株（CntB V19S、E253A；CntC C113A、F143A）的生长曲线；CntBC 异二聚体的同源建模结构，4 个关键残基的空间定位。
数据来源：Fig 4 The critical roles of the identified four key residues for metal acquisition were confirmed by structural modeling and CRISPR/Cas9 and pKOR1-based genome editing experiments. (A) Growth curves of four mutant strains (V19S, E253A of CntB and C113A, F143A of CntC) in the presence of 2 mM Co²+; (B) A modeled structure of CntBC. The residues V19, E253 of CntB and C113, F143 of CntC were highlighted.
研究意义：通过传统同源重组方法验证了 pABE 筛选得到的 4 个残基是 CntBC 金属转运功能的核心位点；结合蛋白结构建模，揭示了这些残基分别通过调控 CntBC 二聚化、溶质进入通道发挥功能，从分子层面阐明了 CntBC 的转运机制，同时进一步证实了 pABE 系统用于细菌遗传筛选的准确性与可靠性。
⑤ pABE 系统的技术参数与编辑保真度数据
数据内容：sgRNA 靶序列 2~10 位腺嘌呤位点的编辑效率；双靶点同时编辑的效率；靶位点深度测序的非预期突变频率；全基因组测序的脱靶事件检测结果。
数据来源：补充材料Fig S1-S6、Table S1-S2
研究意义：系统明确了 pABE 系统在细菌中的可编辑窗口为 sgRNA 靶序列的 4~8 位，证实了其具备多重编辑能力；同时证明该系统具有极高的编辑保真度，无明显脱靶效应，为其在细菌精准基因组编辑中的安全应用提供了关键数据支撑。
⑥ 突变菌株胞内钴离子含量的生化验证数据
数据内容：野生型、ΔcntB 敲除株、CntB V19A 与 E253G 突变菌株的胞内 Co²+ 含量，由 ICP-OES 定量测定。
数据来源：补充材料Fig S8
研究意义：从离子摄取的生化层面，直接证实了 CntB 关键残基的突变会显著降低金黄色葡萄球菌对钴离子的摄取，进一步验证了这些残基在 StP / 金属复合物转运中的核心功能，为 pABE 系统的筛选结果提供了直接的生化证据。
⑦ 实验材料的基础信息数据
数据内容：本研究所用的细菌菌株、质粒、引物的详细信息。
数据来源：补充材料Table S3-S5
研究意义：为实验的可重复性提供了完整的材料信息，为其他研究者重复实验、拓展该系统的应用提供了基础参考。
8. 核心研究结论
① 本研究利用 Cas9 切口酶与腺嘌呤脱氨酶的融合蛋白，成功在细菌中建立了高效、稳健的腺嘌呤碱基编辑系统 pABE，该系统无需同源重组和外源修复模板，即可在细菌基因组中实现精准的 A 到 G 单碱基替换，大幅简化了细菌基因组编辑的操作流程，突破了传统编辑方法对同源重组的依赖。
② pABE 系统在革兰氏阴性的大肠杆菌和革兰氏阳性的金黄色葡萄球菌中均能实现高效编辑，在金黄色葡萄球菌中的可编辑窗口为 sgRNA 靶序列的 4~8 位，同时具备双基因同步编辑的多重编辑能力，拓展了系统的适用场景与宿主范围。③ pABE 系统具有极高的编辑保真度与安全性，靶位点的非预期碱基突变可忽略不计，全基因组范围内未检测到脱靶编辑事件，保障了细菌基因组编辑的准确性。④ 基于 pABE 系统开发了细菌蛋白功能残基的高通量筛选方法，成功对金黄色葡萄球菌 CntBC 转运蛋白的 42 个可编辑腺嘌呤位点进行了规模化突变，筛选并验证了 4 个调控 StP / 金属复合物转运的关键功能残基，证明该系统可用于大规模甚至全基因组范围的细菌功能基因与新机制筛选。
⑤ pABE 系统的成功开发，为其他难编辑细菌中腺嘌呤碱基编辑系统的构建提供了关键参考；后续结合 PAM 拓展型 Cas9 对系统进行改造，将进一步扩大其靶向范围，该系统的广泛应用将极大推动细菌基因组工程、合成生物学与病原微生物研究的发展。
9. 芬兰 Bioscreen 仪器测量的微生物生长曲线数据的研究意义
本研究采用芬兰 BioScreen C 全自动微生物生长曲线分析仪（OY Growth Curves Ltd, Finland），完成了两部分核心生长曲线测定：一是对 pABE 系统构建的 42 株 CntBC 单氨基酸突变金黄色葡萄球菌菌株，在 3 mM Co²+ 胁迫下的生长动态进行了高通量测定，每 0.5 小时检测一次 OD₆₀₀值，持续监测 16 小时，所有实验均设置 3 次技术重复；二是对同源重组方法构建的 4 株关键残基定点突变菌株，在 2 mM Co²+ 胁迫下的生长曲线进行了验证性测定。这些生长曲线数据是本研究筛选和验证 CntBC 关键功能残基的核心依据，其研究意义体现在以下 8 个关键层面：
① 实现了基于碱基编辑的大规模突变体功能表型的高通量、自动化筛选
传统的细菌突变体表型检测依赖手动分光光度计检测，难以实现数十株菌株的同步、连续监测，而 BioScreen 仪器的高通量特性，可同时对数十株突变菌株的生长动态进行全自动、原位、连续检测，完美适配了 pABE 系统规模化构建的 42 株突变体的表型筛选需求。通过生长曲线数据，快速从 42 株突变体中筛选出 4 株可显著缓解高浓度钴离子毒性的菌株，大幅提升了细菌蛋白功能残基筛选的效率，解决了传统同源重组方法难以实现大规模突变体构建与表型筛选的行业瓶颈。
② 建立了 CntBC 蛋白功能残基的快速、定量评价体系
高浓度钴离子对金黄色葡萄球菌的毒性依赖于 CntBC 转运蛋白对 StP - 钴离子复合物的摄取，CntBC 功能失活会导致菌株在高钴环境下的生长抑制被解除。BioScreen 仪器获得的高时间分辨率生长曲线，可通过最大 OD₆₀₀值、比生长速率、迟滞期等定量参数，精准评价单个氨基酸突变对 CntBC 转运功能的影响程度，实现了对蛋白残基功能的半定量分级，而非简单的 “有 / 无” 表型判断，为区分关键功能残基和非关键残基提供了精准的量化依据。
③ 验证了 pABE 系统构建的突变体表型的可靠性，为碱基编辑在细菌遗传筛选中的应用提供了核心表型证据
通过 BioScreen 仪器测定的生长曲线，直观显示了 pABE 系统构建的 CntB B6（E253G）、B10（V19A）和 CntC C5（F143L）、C10（C113R）突变菌株，在高钴环境下的生长能力显著强于野生型菌株，与 cntBC 基因敲除菌株的表型完全一致。这一结果直接证实了 pABE 系统的单碱基编辑可精准实现目标氨基酸的突变，并产生对应的功能表型，从表型层面验证了 pABE 系统编辑的准确性与功能性，为其在细菌遗传筛选中的应用提供了关键的表型支撑。
④ 为关键残基的功能验证提供了可重复、标准化的定量数据
在后续的关键残基验证实验中，利用 BioScreen 仪器对同源重组方法（pCasSA、pKOR1）构建的定点突变菌株（CntB V19S、E253A；CntC C113A、F143A）进行了生长曲线测定，结果显示这些菌株的生长表型与 pABE 系统构建的突变体完全一致。BioScreen 仪器的恒温、同步震荡培养、原位检测的特性，最大程度消除了环境波动、人为操作带来的系统误差，确保了不同实验批次、不同编辑方法构建的突变体表型数据的可比性、重复性与标准化，为关键残基功能的最终确认提供了可靠的、可重复的实验证据。
⑤ 揭示了 CntBC 残基突变对菌株钴离子胁迫适应性的动态影响
传统的终点法 OD 检测仅能获得某一时间点的菌株生长情况，无法反映突变对菌株全生长周期的影响。而 BioScreen 仪器获得的全周期生长曲线，完整捕捉了突变菌株在钴离子胁迫下的迟滞期、对数生长期、平台期的动态变化，可深入分析不同残基突变对菌株胁迫适应能力、生长速率的影响差异，为后续解析 CntBC 转运蛋白的分子机制提供了更丰富的表型信息。
⑥ 从表型层面关联了蛋白残基突变与金属转运功能的因果关系
结合 ICP-OES 测定的胞内钴离子含量数据，生长曲线的表型结果与胞内金属离子含量直接相关：高钴环境下生长能力越强的突变菌株，胞内钴离子含量越低，直接建立了 “单碱基突变 - 氨基酸改变 - 蛋白转运功能失活 - 胞内金属离子摄取减少 - 高钴环境下生长抑制解除” 的完整因果链。BioScreen 仪器提供的生长表型数据，是连接基因型突变与蛋白生化功能的关键桥梁，为残基功能的机制解析提供了核心的表型依据。
⑦ 拓展了 BioScreen 仪器在 CRISPR 碱基编辑与细菌功能基因组学研究中的应用场景
传统上 BioScreen 仪器多用于微生物生长特性、药敏实验、代谢工程菌株筛选等研究，本研究将其创新性地与细菌腺嘌呤碱基编辑技术结合，建立了一套 “规模化单碱基编辑 - 高通量生长曲线表型筛选 - 关键功能残基鉴定” 的完整研究流程，为细菌蛋白功能基因组学、病原微生物毒力因子研究、抗生素靶点筛选提供了全新的技术范式，拓展了该仪器在微生物学与合成生物学领域的应用边界。
⑧ 为基于碱基编辑的细菌全基因组规模遗传筛选提供了方法学基础本研究利用 BioScreen 仪器实现了数十株突变体的同步表型筛选，验证了 “碱基编辑 + 高通量生长表型检测” 策略的可行性与高效性。该方法可进一步拓展至细菌全基因组规模的单碱基编辑文库筛选，结合 BioScreen 仪器的高通量检测能力，可实现对细菌生长、胁迫响应、毒力、耐药性相关关键基因与功能残基的全基因组规模鉴定，为下一代细菌功能基因组学研究提供了强大的技术支撑。