全自动生长曲线分析仪

A New Inactivated Coxsackievirus B2 Vaccine: Biological Properties, Immunogenicity, and Protective Effects in Mice

新型柯萨奇病毒 B2 型灭活疫苗的生物学特性、免疫原性及小鼠体内保护效果研究

来源： Vaccines 2026, 14(4), 290; https://doi.org/10.3390/vaccines14040290

摘要

背景：柯萨奇病毒 B2 型（CVB2）可引发手足口病、心肌炎、急性弛缓性麻痹、脑膜炎和脑炎等多种疾病，目前尚无特效抗病毒药物和疫苗。方法：本研究通过空斑纯化、病毒滴度测定和连续传代筛选鉴定出一株具有高病毒滴度和良好遗传稳定性的 CVB2 灭活疫苗候选株 KM31-C05；对该候选株进行全面生物学表征，包括系统发育分析、BALB/c 小鼠毒力评估、一步生长曲线分析、感染复数优化，以及 BALB/c 乳鼠攻毒后组织中的病毒载量测定、病理评估和免疫组织化学分析；使用 KM31-C05 制备实验性灭活疫苗并评估其免疫原性和保护效力。结果：KM31-C05 的病毒滴度达到 10⁸ CCID₅₀/mL，连续传代 20 次后仅发现 3 个氨基酸突变（VP3-G165V、VP1-N84K 和 VP1-D129N），尽管两个 VP1 突变位于表面暴露环，但该菌株在传代过程中保持高中和滴度，显示出良好的遗传稳定性；系统发育分析表明该菌株属于 C 基因型，与近年来中国大陆流行株一致；由 KM31-C05 制备的实验性灭活疫苗在 BALB/c 小鼠中诱导产生有效中和抗体（1:128–1:256），在母源抗体保护实验中为乳鼠提供了对该 CVB2 株致死性攻毒的完全保护。结论：KM31-C05 在中国具有作为 CVB2 疫苗候选株的潜力，为 CVB2 疫苗的研发提供了理论基础。

关键词

柯萨奇病毒B2型, 生物学特性,动物模型,灭活疫苗,免疫原性

研究目的

筛选并鉴定一株适合制备 CVB2 灭活疫苗的候选毒株，要求具有高滴度、良好遗传稳定性和免疫原性；系统评估候选毒株的生物学特性，包括基因型、毒力、复制能力和组织嗜性；制备基于该毒株的灭活疫苗并在小鼠模型中验证其免疫原性和保护效力；评估母源抗体对新生小鼠的被动保护效果，为 CVB2 疫苗的临床前研究提供实验依据。

研究思路

从云南地区手足口病患者粪便样本中分离的 5 株 CVB2 中，通过三轮空斑纯化获得单克隆毒株；对纯化毒株进行连续传代 20 次，检测其遗传稳定性和病毒滴度，筛选出最优候选株 KM31-C05；对 KM31-C05 进行系统发育分析确定基因型，通过一步生长曲线分析其在 Vero 细胞中的复制特性，优化感染复数和收获时间；利用 3 日龄 BALB/c 乳鼠模型评估其毒力、组织嗜性和病理特征；制备灭活疫苗，通过两次免疫 BALB/c 小鼠评估其免疫原性（中和抗体滴度）；通过母源抗体保护实验评估疫苗对新生小鼠的保护效果，验证其作为疫苗候选株的潜力。

研究亮点

首次从中国云南地区流行株中筛选出 CVB2 疫苗候选株 KM31-C05，其基因型与中国大陆近年来流行株一致，具有良好的地域适应性；候选株连续传代 20 次仅出现 3 个氨基酸突变，且保持高滴度和中和活性，遗传稳定性优异；制备的灭活疫苗在小鼠中诱导产生高水平中和抗体（1:192–1:256），并能通过母源抗体为新生小鼠提供 100% 的致死性攻毒保护；疫苗对多种临床分离株具有交叉中和活性，显示出广谱保护潜力；建立了稳定可靠的 CVB2 乳鼠攻毒模型，为疫苗评价提供了标准化平台。

可延伸的方向

在非人灵长类动物模型中进一步验证 KM31-C05 灭活疫苗的安全性和免疫原性，为临床试验做准备；优化疫苗生产工艺，提高病毒滴度和灭活效率，降低生产成本；评估疫苗对不同基因型 CVB2 流行株的交叉保护效果，开发多价 CVB 疫苗；研究疫苗诱导的细胞免疫应答，全面评估其免疫保护机制；探索黏膜免疫途径（如鼻腔、口服）的免疫效果，开发更便捷的疫苗接种方式；开展疫苗与其他肠道病毒疫苗的联合免疫研究，评估联合免疫的安全性和免疫原性。

测量数据、研究意义及对应原文图表

病毒基因型数据（VP1 基因序列和系统发育分析），用于确定 KM31-C05 的基因型，显示其与中国大陆流行株一致，数据来自Figure 1；

不同 CVB2 毒株的小鼠存活率、体重变化和临床评分数据，用于评估毒株毒力，筛选出高毒力候选株 KM31-C05，数据来自Figure 2；

KM31-C05 不同传代次的全基因组序列和氨基酸突变数据，用于验证其遗传稳定性，数据来自Table 2；

KM31-C05 在 Vero 细胞中的一步生长曲线数据（不同时间点病毒滴度），用于确定其复制特性和最佳收获时间，数据来自Figure 3；

不同感染复数（MOI）下的病毒滴度和 95% CPE 时间数据，用于优化疫苗生产参数，数据来自Table 3；

感染小鼠各组织的病理切片和免疫组化结果，用于确定病毒的组织嗜性，数据来自Figure 4；

感染小鼠各组织的病毒 RNA 载量数据，用于量化病毒在体内的复制和分布，数据来自Figure 5；

不同剂量疫苗免疫后小鼠的中和抗体滴度动态变化数据，用于评估疫苗的免疫原性，数据来自Figure 6；

母源抗体保护实验中新生小鼠的存活率和体重变化数据，用于验证疫苗的被动保护效果，数据来自Figure 7 。

研究结论

KM31-C05 是一株具有高滴度（10⁸ CCID₅₀/mL）、良好遗传稳定性和免疫原性的 CVB2 疫苗候选株，属于 C 基因型，与中国大陆近年来流行株一致；该毒株在 Vero 细胞中复制迅速，MOI 为 0.01 时可获得最佳生产效率和病毒滴度；由其制备的灭活疫苗在 BALB/c 小鼠中诱导产生高水平中和抗体，且能通过母源抗体为新生小鼠提供 100% 的致死性攻毒保护；疫苗对多种临床分离株具有交叉中和活性，但对原型株 Ohio-1 无中和作用；KM31-C05 灭活疫苗安全性良好，无明显不良反应，为 CVB2 疫苗的研发提供了重要的实验依据和候选毒株。

芬兰 Bioscreen 仪器测量的微生物生长曲线数据研究意义

本研究中未使用芬兰 Bioscreen 仪器测量微生物生长曲线，KM31-C05 在 Vero 细胞中的一步生长曲线（Figure 3）是通过传统的 Reed–Muench 法测定不同时间点的病毒滴度（CCID₅₀/mL）绘制的。若采用 Bioscreen C 仪器进行测量，可实现以下研究意义：一是可实时、连续监测细胞培养物的吸光度变化，更精准地捕捉病毒复制的动态过程，包括潜伏期、对数生长期和平台期的精确时间点；二是实现多样品平行检测，提高实验效率和数据重复性，减少人工操作误差；三是获得更丰富的动力学参数，如最大生长速率、延滞期时间等，为病毒复制特性的定量分析提供更全面的数据支持；四是可用于高通量筛选最佳培养条件（如温度、培养基成分），优化疫苗生产工艺；五是为疫苗株的质量控制提供标准化的体外检测方法，确保疫苗生产的稳定性和一致性。