全自动生长曲线分析仪

Study on the immune efficacy of three adjuvants in an inactivated vaccine against Photobacterium damselae subsp. damselae in Zebrafish (Danio rerio)

三种佐剂对美人鱼发光杆菌美人鱼亚种灭活疫苗免疫效果的研究

来源：黑龙江水产 (2026 年第 1 期)

摘要

近年来，美人鱼发光杆菌美人鱼亚种（Photobacterium damselae subsp. damselae）对水生动物的侵染日益增多，而依赖抗生素治疗易导致耐药性和食品安全问题。灭活疫苗与佐剂联用可显著增强免疫效果。该研究旨在评估三种佐剂（黄芪多糖、弗氏完全佐剂、4% 氢氧化铝凝胶）对美人鱼发光杆菌灭活疫苗免疫效果的增强作用。首先优化了甲醛灭活条件，确定最佳浓度为 0.4%（v/v），作用时间为 8 h。随后，通过腹腔注射免疫斑马鱼（Danio rerio），并进行攻毒实验。结果显示，单独灭活疫苗组的免疫保护率（RPS）为 58.3%，而联合黄芪多糖、弗氏完全佐剂和氢氧化铝凝胶佐剂的疫苗组 RPS 分别为 74%、45.8% 和 62.5%。进一步监测非特异性免疫指标（ACP、AKP、CAT、SOD、MDA、LZM）的动态变化发现，黄芪多糖佐剂组能显著（P<0.05）并持续地增强机体的免疫应答水平，且安全性较好。综上，黄芪多糖是增强美人鱼发光杆菌灭活疫苗免疫效果的最优佐剂，该研究为开发高效安全的水产疫苗提供了试验依据。

关键词

黄芪多糖，灭活疫苗，佐剂，斑马鱼，美人鱼发光杆菌美人鱼亚种

研究目的

筛选美人鱼发光杆菌美人鱼亚种的最优甲醛灭活条件，制备安全有效的灭活抗原。

对比黄芪多糖、弗氏完全佐剂、4% 氢氧化铝凝胶三种佐剂与灭活疫苗联用的免疫增强效果。

以斑马鱼为模型，评估不同佐剂疫苗的免疫保护率、非特异性免疫指标、安全性。

确定适配该水产疫苗的最佳佐剂，为海水养殖鱼类细菌性疾病防控提供候选方案。

研究思路

病原灭活：采用甲醛灭活法，优化浓度（0.4%）与时间（8 h），制备灭活疫苗抗原。

分组设计：设空白对照组、单独疫苗组、黄芪多糖佐剂组、弗氏佐剂组、氢氧化铝佐剂组。

免疫程序：斑马鱼腹腔注射免疫，定期采血检测非特异性免疫酶活。

攻毒保护：免疫后用强毒菌株攻毒，统计累计死亡率与相对保护率（RPS）。

综合评价：结合抗体水平、酶活数据、保护率、安全性，筛选最优佐剂。

研究亮点

水产靶向性：针对海水养殖高发的美人鱼发光杆菌，填补该病原佐剂筛选空白。

天然佐剂优势：证实 ** 黄芪多糖（中药来源）** 优于传统弗氏与铝胶佐剂，安全、高效、无残留。

指标全面：同时检测6 种非特异性免疫酶（ACP、AKP、CAT、SOD、MDA、LZM），系统评价免疫激活。

模型适用：采用斑马鱼模式动物，实验周期短、成本低、结果可靠，易推广至海水经济鱼类。

实用导向：优化灭活工艺，佐剂易获取、成本低，适合水产养殖规模化应用。

可延伸的方向

靶动物验证：在大黄鱼、鲈鱼、石斑鱼等主养海水鱼中开展田间试验。

联合免疫：开发美人鱼发光杆菌 + 鳗弧菌 + 哈维氏弧菌多联灭活疫苗。

佐剂复配：黄芪多糖 + 壳聚糖 / 纳米载体复合佐剂，进一步提升黏膜与持久免疫。

免疫途径：探索浸泡、口服、喷雾等更便捷的水产疫苗给药方式。

机制研究：深入解析黄芪多糖激活 TLR/MyD88 通路、促进细胞因子表达的分子机制。

工艺优化：冻干制剂、疫苗浓度、佐剂配比放大生产，降低养殖应用成本。

测量数据、研究意义及对应原文图表

甲醛灭活条件优化（浓度 0.4%、时间 8 h）数据，用于确定疫苗制备的安全有效工艺，数据来自TAB 3。

不同佐剂组斑马鱼免疫后ACP、AKP、CAT、SOD、LZM 酶活及 MDA 含量动态变化数据，用于评价非特异性免疫激活强度与持续时间，数据来自Figure 1。

攻毒后各组累计死亡率、相对保护率（RPS）数据，用于验证疫苗的实际保护效果，数据来自Tab 4。

免疫后斑马鱼注射部位炎症反应、生长状况安全性数据，用于评估佐剂与疫苗的生物安全性，数据来自Table 1。

研究结论

0.4% 甲醛作用 8 h 可完全灭活美人鱼发光杆菌，且保留良好抗原性。

三种佐剂中，黄芪多糖佐剂组效果最优：RPS 达 74%，显著高于单独疫苗组（58.3%）、弗氏佐剂组（45.8%）及氢氧化铝组（62.5%）。

黄芪多糖可持续、显著提升ACP、AKP、SOD、LZM 等免疫酶活性，降低 MDA 氧化损伤，全面增强机体免疫应答。

黄芪多糖佐剂安全性高，无明显局部炎症与生长抑制，适合水产养殖应用。

黄芪多糖可作为美人鱼发光杆菌灭活疫苗的首选佐剂，为海水养殖鱼类免疫防控提供高效、安全的新方案。

芬兰 Bioscreen 仪器测量的微生物生长曲线数据研究意义

本论文未使用 Bioscreen 仪器，但在同类水产疫苗研发中，Bioscreen C 全自动微生物生长分析仪具有关键研究价值：

灭活工艺精准质控：实时监测不同甲醛浓度 / 时间处理后病原菌的生长抑制曲线，精确判定完全灭活临界点（OD600 无上升），替代传统菌落计数，更灵敏、更客观、可定量。

抗原稳定性评价：监测灭活疫苗 + 不同佐剂在储存条件下的病原菌复苏生长，验证疫苗无菌性与稳定性，保障生产与使用安全。

佐剂体外抑菌筛选：定量检测黄芪多糖等佐剂对美人鱼发光杆菌的直接抑菌 / 杀菌动力学（延滞期延长、生长速率降低、最大 OD 下降），高通量快速筛选抑菌型佐剂，减少动物实验。

免疫血清杀菌活性（SBA）：将免疫斑马鱼血清与病原菌共培养，Bioscreen 实时监测细菌生长抑制，定量、动态、高通量评价血清杀菌能力，关联体内保护率。

疫苗抗原浓度优化：监测不同抗原浓度的免疫原性相关生长抑制 / 抗体效价曲线，确定最低有效抗原剂量，降低疫苗生产成本。

规模化发酵质控：100-200 样品平行检测病原菌培养生长曲线，自动化、高重复性，为疫苗抗原大规模发酵生产提供标准化质控，确保批次一致性。

简言之，Bioscreen 可将本研究的灭活工艺、佐剂筛选、免疫评价从 “定性 / 半定量” 升级为精准、动态、高通量、可标准化的定量体系，大幅提升水产疫苗研发效率与质量控制水平。