白腐真菌能够分解木质素和秸秆纤维吸引人们进行广泛的研究。采用白腐真菌处理玉米和油菜秸秆,结果表明在发酵培养20 d时,油菜秸秆的木质素降解率达到58.07%;在发酵35 d时,玉米秸秆的木质素降解率达到33.62%。采用侧耳菌(平菇)处理稻草秸秆,木质纤维成分比处理前降低11.94%~14.7%。利用多种菌处理秸秆,结果显示黄孢原毛平革菌和侧耳菌的木质素降解率均为27%左右,但前者纤维素的降解率为42%,而侧耳菌纤维素降解率仅有18%。降低秸秆中木质素含量,而保留纤维素是处理秸秆的目标。以上研究结果表明平菇生长速度较快,可利用多种木质纤维物质生长,且要求的生存条件较低,是目前处理秸秆饲料的主要菌种之一。虽然平菇生长较快,但至少也需要20 d,所以提高菌种的生长速度和抗逆性是提高秸秆饲料营养价值的关键。紫外诱变(UV)是最简单和常用的提高菌种生长速度和产酶量的真菌育种技术。
用紫外线照射糙皮侧耳的原生质体筛选出高效分解秸秆的菌株08P217,处理秸秆后木质素和纤维素的降解率均提高0.7倍以上。为此,在北方气候条件下,以生长速度较快的侧耳菌为出发菌株,采用紫外诱变技术,培育生长速度较快和产酶量较高的菌株,以提高处理秸秆的效率,为采用白腐真菌处理秸秆饲料提供理论依据和技术参数。
1、材料与方法
1.1菌种及试剂
菌种:试验所用平菇购于黑龙江省微生物研究所,经过本实验室筛选获得优良菌种P2。
平板与斜面培养基(PDA):20%土豆汁、2%的葡萄糖、2%琼脂,pH值自然。
初筛平板培养基:1%麦芽糖、2%葡萄糖、0.2%酵母膏、0.2%蛋白胨、0.05%MgSO4·7H2O、0.4%KH2PO4、2%琼脂、0.5 mmol/l愈创木酚。
秸秆粉试管培养基:粉碎玉米秸秆87%(其纤维组成见表1)、小麦麸8%、石灰5%、料水比1∶2、121℃灭菌30 min,pH值自然。
表1玉米秸秆粉培养基纤维组成(%)
1.2试验方法
1.2.1菌株的活化与保存
将保存的菌种接种到PDA斜面培养基上,在25℃培养7 d,再转接活化2~3次,于4℃保存备用。
1.2.2孢子悬液的制备
用钟罩法收集孢子于无菌蒸馏水中,适当稀释,血球板法计数,使孢子浓度为1×108个/ml,于4℃保存备用。
1.2.3紫外线诱变剂
经过试验确定紫外照射孢子的致死率为70%~80%时为最佳诱变剂量,将所储备的孢子连续诱变10批,照射后在红光灯下适当稀释,分别涂布于PDA培养基中,无处理的孢子液作对照,置于25℃培养箱中避光培养。挑选出优先萌发且长势良好的菌株接入斜面培养基。
1.2.4初选
①通过菌丝生长情况的比较,在斜面培养基上进行初筛,从中选出长速快于对照菌株、长势好、菌丝粗壮洁白的菌株与亲本进行拮抗试验,挑选拮抗程度较大的菌株。
②用打孔器将等量诱变菌株菌块接种于初筛平板培养基上,从中挑选变色圈大的菌株,以出发菌为对照。结合生长和产酶两个因素,表现突出的诱变菌株进入复选。
1.2.5复选
1.2.5.1 PDA试管菌株长速的比较
将筛出的菌株在培养基上传代3次,取等量菌块接种于斜面PDA试管,以出发菌为对照,每株菌5个重复,25℃下恒温避光培养。待菌丝萌发长齐后划线,以游标卡尺(精确度0.02 mm)测量各菌菌丝的生长速度。
1.2.5.2酶活性及纤维降解率比较
将筛选出的菌种按试验分组接种到秸秆粉试管,以出发菌为对照,每株菌5个重复,在25℃恒温避光培养,菌丝20 d都长满秸秆粉试管,于此时进行相关的测定。参照巩竞的方法,取复筛菌株试管秸秆粉各4 g,打碎,混匀,加双蒸水40 ml,置于4℃冰箱中浸提过夜;次日,用4层纱布过滤离心,取上清即得粗酶液,4℃低温保藏。其残渣65℃下烘至恒重用于粗纤维成分的测定。
1.3测定指标及方法
致死率(%)=[对照菌数量(cfu)-处理后菌数量(cfu)]/对照菌数量(cfu)×100;
菌丝生长速度(mm/d)=菌丝长度(mm)/菌丝生长时间(d)。
木质素过氧化酶(LiP)酶活的测定:采用亚甲基蓝法;漆酶(Lac)酶活的测定:采用邻联甲苯胺法;纤维素酶酶活的测定:采用DNS法。
发酵秸秆纤维成分的测定:采用ANKOM220 Fiber Analyzer仪器,按照Van Soest分析法,分析中性洗涤纤维(NDF)、酸性洗涤纤维(ADF)、半纤维素(HCEL)、纤维素(CEL)和木质素(ADL)。
1.4数据统计
试验数据以“平均值±标准差”表示,采用SPSS 17.0软件中的One-Way ANOVA过程进行单因素方差分析,Duncan's法进行各组间多重比较,以P<0.05作为差异显著性判断标准。