2.2最小抑菌浓度
MIC是衡量抑菌物质抑菌能力的重要指标之一。不同浓度的P2和P3对腐生葡萄球菌的抑菌效果如图2所示。当P2和P3质量浓度≥0.78 mg/mL时，同一浓度下与对照组相比，实验组吸光值变化不大，说明腐生葡萄球菌生长受到抑制;当P2和P3质量浓度<0.78 mg/mL时，同一浓度下与对照组相比，实验组吸光值增加，说明在该浓度范围P2和P3不能抑制或不能完全抑制腐生葡萄球菌的生长。实验结果表明P2、P3的最小抑菌浓度均为0.78 mg/mL。
A-P2实验组;B-P3实验组
图2鳜鱼多肽-锌螯合物对腐生葡萄球菌的抑菌效果
2.3生长曲线
细菌生长曲线能够反映菌株生长状况。由图3可知，对照组腐生葡萄球菌生长曲线呈“S”型趋势，在0～2 h是生长潜伏期，2～12 h为指数生长期，12 h后进入生长平稳期。P2和P3以0.25 MIC作用于腐生葡萄球菌时，细菌难以进入指数生长期;在MIC的P2和P3作用下，腐生葡萄球菌生长可完全被抑制。生长曲线实验结果表明，P2和P3对腐生葡萄球菌的生长具有较强的抑制作用。陈梦玲等研究发现，牛至精油可延缓腐生葡萄球菌进入指数生长期，与本实验结果相似。
A-P2实验组;B-P3实验组
图3鳜鱼多肽-锌螯合物对腐生葡萄球菌生长曲线影响
2.4电导率值
当菌体细胞受到外界不良影响时，细胞膜渗透性会改变，胞内电解质外渗，此时可通过菌悬液电导率的变化判断菌体的受损情况。由图4可知，添加MIC和0.5 MIC的P2和P3实验组与对照组的电导率变化趋势相似，都呈现先快速上升后缓慢增长的趋势;添加不同浓度P2和P3的实验组2～4 h内电导率显著高于对照组(P<0.05)，说明P2和P3均可破坏腐生葡萄球菌细胞膜的通透性，使细胞内电解质外泄;随着时间的延长，对照组电导率与添加不同浓度P2和P3的实验组电导率相近，推测是菌体出现自溶现象所致。由此可推测，P2和P3可通过增强腐生葡萄球菌细胞膜通透性，抑制细菌正常生长代谢，从而造成菌体死亡。徐小烽等采用同样的方法研究鲢鱼重组Cystatin C对腐生葡萄球菌和铜绿假单胞菌的抑菌机理，结果表明鲢鱼重组Cystatin C能够破坏铜绿假单胞菌和腐生葡萄球菌细胞膜完整性，使细胞膜通透性增强，结论与本实验相似。
A-P2实验组;B-P3实验组
图4鳜鱼多肽-锌螯合物对腐生葡萄球菌细胞外电导率影响
注:同一时间点下不同处理组之间字母不同代表差异显著(P<0.05)(下同)。
2.5紫外吸收值
细菌培养液内蛋白质和核酸含量是评价细菌细胞膜破环程度的重要指标。由图5可知，随着培养时间的延长，对照组培养液在260 nm和280 nm处吸光值变化不大，说明对照组培养液中核酸和蛋白质含量相对稳定;添加MIC和0.5 MIC的P2和P3实验组在260 nm和280 nm处吸光值整体上升，且吸光值在2～8 h内均显著高于对照组(P<0.05)，说明P2和P3均可破坏细菌细胞膜完整性，导致胞内核酸、蛋白质等物质流出;P3在260 nm和280 nm处的吸光值始终高于P2，说明P3对腐生葡萄球菌细胞膜破环程度大于P2，与前文抑菌圈实验结果相符合。由此可以推断，P2和P3可破坏腐生葡萄球菌的细胞膜，从而抑制细菌生长繁殖，YE等研究曲酸对腐生葡萄球菌细胞膜的破坏性，也得到相似的结论。
A-P2实验组(OD260nm);B-P3实验组(OD260nm);C-P2实验组(OD280nm);D-P3实验组(OD280nm)
图5鳜鱼多肽-锌螯合物对腐生葡萄球菌细胞膜完整性影响
2.6 SOD和CAT活力
SOD和CAT对细菌细胞内抗氧化系统起着重要的防御作用。由表2可以看出，0～8 h内加入MIC和0.5 MIC的P2和P3后SOD活力显著高于对照组(P<0.05)，说明P2和P3能够大幅度提高腐生葡萄球菌胞内SOD活力，从而影响菌体正常生长代谢;添加MIC的P2和P3比添加0.5 MIC的P2和P3的SOD活力提升得更高，说明P2和P3对腐生葡萄球菌SOD活力影响具有浓度依赖性;2～8 h添加MIC的P2处理组CAT活力显著低于对照组(P<0.05)，添加MIC的P3在2～6 h内CAT活力也低于对照组。由此可推测，P2和P3可通过提升腐生葡萄球菌SOD活力和降低CAT活力来影响菌体正常生长。黄伟英等采用试剂盒方法测定乳酸链球菌素对腐生葡萄球菌的抑菌机制，结果表面乳酸链球菌素可通过降低腐生葡萄球菌SOD和CAT活力使菌体抗氧化动态失衡，导致菌体生长受到抑制。
表2多肽-锌螯合物对腐生葡萄球菌SOD和CAT活力影响单位:U/mL
注：同一列的不同字母代表差异显著(P<0.05)。
2.7生物扫描电镜
SEM可从细菌的菌体形态上直观反映鳜鱼多肽-锌螯合物对腐生葡萄球菌菌体结构的影响。由图6可知，添加酶解液的对照组菌体大小均匀，呈现饱满的圆球状，表面光滑平整，说明菌体细胞结构完整，生长良好。MIC和0.5 MIC的P1和P2处理组菌体形状不规则、表面粗糙褶皱、无充盈感、扭曲变形、部分菌体细胞出现破损、内容物外泄、相互黏附现象，且MIC P3处理组菌体胞膜大量剥落、破裂畸形，细胞损伤最严重。由此可推测，P2和P3可通过破坏腐生葡萄球菌的菌体结构抑制细菌生长繁殖。ZHANG等采用SEM观察经复合保鲜剂处理后的腐生葡萄球菌，菌体表面出现干瘪，凹陷，相互黏附，破碎，研究结果与本实验相似。
A-酶解液处理组;B-MIC P2处理组;C-0.5MIC P2处理组;D-MIC P3处理组;E-0.5MIC P3处理组
图6酶解液和鳜鱼多肽-锌螯合物处理后腐生葡萄球菌扫描电镜图
3结论
本研究以鳜鱼肉为原料，经风味蛋白酶酶解制得水解物，之后与ZnSO4·7H2O螯合，再经“离心-醇沉法”和“醇沉-离心法”制备出鳜鱼多肽-锌螯合物P1、P2和P3。探究P1、P2和P3的抑菌活性，抑菌圈实验结果显示P2和P3对腐生葡萄球菌的抑菌效果更佳;P2和P3对腐生葡萄球菌的MIC均为0.78 mg/mL。腐生葡萄球菌的抑菌机制的解析为:P2和P3能够增加细胞膜通透性、破坏细胞膜完整性、改变细菌结构、提升细菌胞内SOD活力和降低CAT活力，从而达到抑菌作用。其中，抑菌圈、紫外吸收和生物扫描电镜实验结果显示，P3的抑菌效果优于P2，可能是P3=P1+P2的缘故，2种螯合物协同作用时能够达到更好的抑菌效果。研究结果表明，鳜鱼多肽-锌螯合物可以作为抑制腐生葡萄球菌的备选剂之一，未来本团队将继续研究鳜鱼多肽-锌螯合物促进水产品保鲜的机理。
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