胃肠道环境相关条件的影响
(i) pH和渗透压。 肠道细菌遇到的重要胁迫条件包括变化的pH和渗透压。选择了不明显影响悬浮生长的条件来测试它们对生物膜形成的影响。在所有测试的培养基中，初始pH为4.0时，鼠李糖乳杆菌GG的生物膜形成受到抑制，而对照培养基为中性pH。将渗透压和离子强度增加到仅轻微减少了鼠李糖乳杆菌GG的生物膜形成。
(ii) 胆汁。 胆汁酸是存在于人类肠道中的表面活性分子，生理浓度范围为0.1%至2.0%。它们具有强大的抗菌活性，但许多肠道和益生菌如鼠李糖乳杆菌GG已发展出抵抗胆汁的机制。先前研究表明胆汁酸可增加肠道病原体的粘附和生物膜形成。我们观察到在AOAC培养基中添加0.05%至0.2%胆汁酸后，生物膜形成增加两到四倍。当添加1.5%胆汁酸时，效果不那么明显，可能是因为革兰氏阳性菌对胆汁的耐受性在浓度超过0.3%时迅速下降。向mTSB培养基中添加0.05%胆汁也使生物膜形成增加约两倍，但增加胆汁浓度逐渐降低了生物膜形成。因此，在mTSB培养基中，表面活性胆汁酸的活性似乎被部分掩盖了。TSB中存在的豆蛋白已被证明可以结合胆汁酸并使其聚集。
(iii) 粘蛋白。 覆盖上皮细胞的粘液层被认为是细菌粘附和定植的重要位点。先前报道粘蛋白对生物膜形成有正面和负面影响，取决于测试的细菌种类。粘蛋白刺激了共生大肠杆菌的生物膜形成，但抑制了胃定植菌幽门螺杆菌的生物膜形成。当我们将粘蛋白以估计存在于横结肠中的浓度添加到mTSB培养基时，我们观察到鼠李糖乳杆菌GG的生物膜形成增加了20%以上。然而，粘液对鼠李糖乳杆菌GG的影响似乎是培养基依赖性的。在AOAC培养基中，粘蛋白没有刺激生物膜形成。
(iv) 不可消化碳水化合物。 未消化的复杂碳水化合物在下部胃肠道环境中尤其具有作用。在此，我们研究了鼠李糖乳杆菌GG无法发酵的菊粉型益生元的影响。在mTSB或AOAC培养基中添加菊粉或其衍生物Synergy1，可使生物膜形成增加高达1.5倍。这种生物膜增强效应主要在长链多糖中观察到。
(v) 抗菌肽。 靠近肠上皮的不同抗菌肽的存在可能在健康受试者中直接粘附于肠上皮的共生菌的缺失中起重要作用。最近报道，由腺上皮细胞和中性粒细胞表达的铁螯合肽乳铁蛋白可阻断机会性病原体铜绿假单胞菌在粘膜表面的生物膜发育。然而，在测试浓度为20和100 μg/ml时，未观察到乳铁蛋白对益生菌鼠李糖乳杆菌GG生物膜发育的影响。
图3. 模拟胃肠道条件对鼠李糖乳杆菌GG生物膜形成的影响。研究了向mTSB（黑色）和 AOAC 培养基（灰色）中添加黏液（2.5克/升）、菊粉型益生元（20克/升）、胆汁（0.05%至2.0%）及乳铁蛋白（100 g/ml）的效果。此外，还评估了将生物膜培养基的pH和渗透压调整为0.3 M氯化钠的影响。补充了mTSB和 AOAC 培养基中的生物膜形成情况分别与未补充mTSB和 AOAC 培养基中的鼠李糖乳杆菌GG（阳性对照，取值为100%[虚线]）进行了比较。
EPS的作用
EPS在生物膜发育中起关键作用。我们选择分析敲低wzb同源物的效果，因为Wzb是一种磷酸酪氨酸蛋白磷酸酶，已被证明在不同细菌中与蛋白酪氨酸激酶结合调节EPS生物合成和聚合物大小。在洋葱伯克霍尔德菌中，当wzb同源物bceD失活时，生物膜形成减少。我们首先分离并鉴定了鼠李糖乳杆菌的wzb同源物，并通过反义RNA技术研究了其在鼠李糖乳杆菌GG生物膜形成中的作用。通过pCMPG5344过表达wzb的反义RNA对生物膜形成显示出培养基依赖性的影响。在AOAC培养基中，wzb表达的沉默导致生物膜形成的减少最大，而在其他培养基中仅观察到轻微影响。为了研究生物膜形成与EPS产生之间可能的联系，分离了在不同培养基中生长的鼠李糖乳杆菌GG的EPS组分。EPS的产生被证明是培养基依赖性的。AOAC培养基诱导了鼠李糖乳杆菌GG最高的EPS产量。这与pCMPG5344的结果一起表明，生物膜形成似乎在AOAC培养基中特别依赖于EPS。
图4. 遗传因素对鼠李糖乳杆菌GG生物膜形成的影响 (A) 在不同培养基（mTSB、 AOAC 及无葡萄糖MRS培养基MRS glc）中，通过过表达反义wzb RNA对鼠李糖乳杆菌GG菌株CMPG5344的胞外多糖（EPS）表达进行研究。随后将生物膜形成情况与空载体pLAB1301转化的鼠李糖乳杆菌GG（阳性对照）进行比较，并添加红霉素以维持质粒稳定表达。(B) 通过分析dltD突变体CMPG5540在相同条件下的表型特征，探究LTA的D-丙氨酰化修饰对生物膜形成的影响，并与野生型鼠李糖乳杆菌GG（阳性对照）在相同条件下的生物膜形成进行对比。(C) 通过分析luxS突变体CMPG5412在不同条件下的表型特征，研究中心代谢功能的影响。将突变体的生物膜形成情况与野生型鼠李糖乳杆菌GG（阳性对照）在相同条件下的表现进行比较，后者作为100%基准值（虚线表示）。
图5.不同培养基中鼠李糖乳杆菌GG菌株胞外多糖（EPS）产量水平对比。研究区分了两种EPS组分：EPS-b和EPS-r。EPS组分分离自鼠李糖乳杆菌GG菌株在MRS培养基（OD600=2.0）、 AOAC 培养基（OD600=1.5）及mTSB培养基（OD600=0.5）中生长的稳定期培养物。由于不同培养基中的最终光密度值差异显著，结果以每109 CFU 产生的葡萄糖当量克数表示。
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