材料与方法
细菌菌株
使用变形链球菌UA159血清型c（ATCC 700610），一种经过验证的毒性致龋牙科病原体，已完成基因组测序；内氏放线菌ATCC 12104；以及口腔链球菌ATCC 35037来生成混合菌种生物膜。除了变形链球菌，我们还选择了口腔链球菌和内氏放线菌，因为这三种微生物存在于人类的龈上菌斑中。口腔链球菌结合获得性膜，是在无蔗糖情况下唾液包被牙齿表面最常见的先驱定植者之一；ATCC 35037菌株也能从蔗糖产生可溶性葡聚糖并且耐酸。内氏放线菌也在菌斑形成的早期阶段被检测到，可能与根面龋的发展有关；ATCC 12104菌株产酸并产生果聚糖。
此外，从亲本株变形链球菌UA159构建了 gtfB, gtfC 和 gtfBC 无效突变株，通过标准的等位基因置换与非极性卡那霉素抗性标记进行，并通过DNA序列分析验证。这些菌株由Robert A. Burne博士慷慨提供。使用前通过PCR检查菌株。培养物保存在含20%甘油的胰酪大豆肉汤中，置于-80°C。
混合菌种生物膜模型
该生物膜方法基于使用唾液包被的羟基磷灰石盘的批次培养方法，旨在根据“生态菌斑-生物膜”概念模拟生物膜的形成，如Koo等人最近所述。变形链球菌UA159、内氏放线菌ATCC 12104和口腔链球菌ATCC 35037细胞在超滤的缓冲胰蛋白胨-酵母提取物肉汤（含1%葡萄糖，pH 7.0）中于37°C和5% CO₂下生长至指数中期；超滤过程去除了可能干扰我们分析的高分子量甘露聚糖和其他多糖。然后将这些细菌悬液混合，提供一个具有定义的微生物种群的接种物：变形链球菌（10⁶ CFU/ml）、内氏放线菌（10⁶ CFU/ml）和口腔链球菌（10⁷ CFU/ml），这对于我们模型的可重复性至关重要。生物膜在涂有过滤灭菌的澄清全唾液的羟基磷灰石盘上形成，这些盘子垂直放置在使用定制盘架中。将变形链球菌、内氏放线菌和口腔链球菌的混合种群接种到2.8毫升含0.1%（w/v）蔗糖的UFTYE中，并在37°C和5% CO₂下孵育。在此期间，微生物不受干扰地生长以允许初始生物膜形成。此时，更换新鲜培养基，生物膜继续生长至29小时以建立初始生物膜群落。在生物膜生长29小时时，将生物膜转移到含1%（w/v）蔗糖或1%（w/v）葡萄糖的UFTYE中以诱导环境变化模拟致龋挑战，而另一组生物膜则在含0.1%蔗糖的UFTYE中生长。然后每天更换两次培养基，直至实验期结束。
使用标准pH电极每日测定废弃培养基的pH值。在特定时间点（29、43、67、91和/或115小时）通过共聚焦成像/荧光、生化分析、逆转录定量PCR（RT-qPCR）及多维蛋白质鉴定技术（MudPIT）对生物膜进行分析。此外，在存在gtfB和/或gtfC缺陷型变形链球菌UA159突变株的条件下也构建了混合菌种生物膜，因为这些基因对不溶性EPS合成及体内毒力表达至关重要。未纳入gtfD突变体，因其对基质形成及生物膜结构无显著影响。本研究中所有gtf突变体在浮游生长速率（以OD600 nm为监测指标）方面与UA159相似，该数据通过自动化浊度Bioscreen C MBC系统（Oy Growth Curves Ab Ltd，赫尔辛基，芬兰）测定获得。
激光扫描共聚焦荧光显微镜对生物膜基质的成像
通过在胞外多糖基质合成过程中直接加入荧光标记物来确定基质的顺序组装，从而允许检查完整生物膜内的三维结构。简而言之，从生物膜发育开始到结束，向培养基中加入1 μM Alexa Fluor 647标记的葡聚糖偶联物。该技术基于以下观察：（荧光标记的）葡聚糖可作为Gtfs（特别是GtfB）的引物和受体，并在胞外酶在生物膜发育过程中合成胞外多糖基质时被掺入新形成的葡聚糖中；在本研究使用的浓度下，它不会染色细菌细胞。使用SYTO 9绿色荧光核酸染料按照标准方案标记生物膜中的所有细菌种类。使用配备10x或25x水浸物镜的Olympus FV 1000双光子激光扫描显微镜进行成像。激发波长为810 nm，SYTO 9的发射波长滤波器为495/540 OlyMPFC1滤波器，而Alexa Fluor 647的滤波器为HQ655/40M-2P滤波器。在每个生物膜的显微镜载物台上随机选择的5个位置进行扫描，并通过在每个位置进行光学切片生成共聚焦图像系列。进行了三次独立的生物膜实验，每次实验收集10个图像堆栈用于量化或可视化。
共聚焦生物膜图像的计算分析
使用软件对完整生物膜内的胞外多糖和细菌细胞进行同步可视化和定量分析。使用Amira 5.0.2创建生物膜每个结构组分的3D渲染图，以可视化形态和3D结构。使用COMSTAT和新开发的DUOSTAT进行定量分析。COMSTAT和DUOSTAT作为MATLAB 5.3的脚本编写，将共聚焦图像堆栈中的像素转换为数值，便于对3D生物膜图像中每个结构组分进行定量表征。我们使用COMSTAT计算微菌落的生物量、数量和大小。开发DUOSTAT是为了计算整个3D生物膜结构中两个生物膜组分的共定位。该软件叠加来自同一生物膜的共聚焦图像数据集，并计算与胞外多糖共定位的总细菌图像像素的比例。
非侵入性三维原位pH测量和可视化
在不破坏其结构完整性的情况下表征生物膜内微环境的能力是一个主要的技术挑战。我们使用荧光pH指示剂Lysosensor yellow/blue来确定我们生物膜模型中的原位pH值。Lysosensor yellow/blue与葡聚糖偶联，这使得标记的葡聚糖可以直接掺入胞外多糖基质中，如前所述。一旦掺入生物膜基质，就可以基于双波长荧光团的荧光强度比值来测量pH值。Lysosensor yellow/blue表现出pH依赖的双发射光谱峰。pH测量的原理是荧光团的质子化会使其发射光谱发生移动，使得离子浓度增加时一个波长的荧光强度增加，而另一个波长则减少。使用Image J 1.44及其计算工具测量每个生物膜图像内两个发射波长的荧光强度和荧光强度比值。如前所述计算比值相对于pH的滴定曲线，并用于将Lysosensor yellow/blue的发射荧光强度比值转换为pH值。两个波长的强度比值作为pH的定量测量，Lysosensor yellow/blue特别适用于酸性环境，正如我们生物膜模型中所预期的。
在将Lysosensor掺入的生物膜放入Na₂HPO₄-柠檬酸缓冲液（pH 7.0）中孵育前后采集其共聚焦图像。在中性缓冲液中孵育10、30、60和120分钟后采集图像，以评估整个完整3D生物膜结构中pH的空间分布。对于pH测量，使用滴定曲线和Image J软件将每个生物膜图像内选定区域的荧光强度比值转换为pH值。为了可视化3D生物膜结构内的原位pH分布，使用Image J重建所有共聚焦图像的荧光强度比值，然后使用Amira处理。使用Amira工具箱将荧光强度转换为灰度，以关联从pH 7.0到3.5的pH范围。还对未标记的生物膜进行了成像，以检查生物膜各组分的自发荧光是否会干扰在我们研究中所用波长和激光强度下的pH定量；根据我们的图像分析，没有干扰。
混合菌种种群的微生物学分析
在特定时间点取出生物膜，并通过在无菌0.89%（w/v）NaCl溶液中超声破碎进行匀浆；此超声程序不会杀死本研究中使用的任何细菌种类。使用匀浆悬浮液，通过自动EddyJet螺旋接种器在血琼脂平板上涂布以确定活细胞数量。通过观察菌落形态并结合对选定菌落细胞的显微镜检查来区分这三种物种。此外，还使用针对变形链球菌、内氏放线菌和口腔链球菌的物种特异性引物通过qPCR评估细菌种群。使用Beacon Designer 2.0软件设计内氏放线菌和口腔链球菌的物种特异性引物。如前所述，使用基于每种微生物基因组大小的标准曲线进行细菌细胞定量。数据表示为总数量以及每种细菌在生物膜内的比例。
使用多重RT-qPCR进行变形链球菌基因表达分析
我们进行了RT-qPCR来测量与胞外多糖基质发育直接相关的特定基因的表达谱，包括 gtfB, gtfC, gtfD, fruA, ftf 和 dexA。使用针对生物膜优化的方案提取和纯化RNA。我们所有样品的RNA完整性数均≥9.0，通过Agilent 2100 Bioanalyzer芯片毛细管电泳确定。简而言之，使用0.5 μg纯化的RNA和BioRad iScript cDNA合成试剂盒合成cDNA。为了检查DNA污染，将不含逆转录酶的纯化总RNA作为阴性对照。所得的cDNA和阴性对照使用特异性引物和TaqMan探针以及iQ Multiplex Powermix通过Bio-Rad CFX96系统进行扩增。为每个引物组绘制标准曲线。使用标准曲线将临界循环阈值转换为cDNA分子的相对数量。通过将每个目的基因标准化到作为参考基因的16S rRNA基因来计算比较表达量。
通过MudPIT进行变形链球菌蛋白表达分析
我们还检查了变形链球菌基因表达的变化是否反映了其在生物膜中相应蛋白产物的水平。通过MudPIT和先前描述的特异性数据库搜索算法分析了整个生物膜中的变形链球菌蛋白表达谱。简而言之，在蛋白酶抑制剂混合物存在下，通过超声破碎对生长67和115小时的生物膜进行匀浆。匀浆后，取等分试样用于通过qPCR进行细菌定量和总蛋白定量。提取总蛋白，沉淀，并用胰蛋白酶消化。使用ProLuCID算法或Sequest算法将MS/MS谱图与NCBI-RefSeq变形链球菌和口腔链球菌数据库进行搜索，该数据库与一个诱饵数据库串联。所有搜索均在由100个1.2 GHz Athlon CPU组成的Beowulf计算机集群上并行进行。使用DTASelect程序组装和过滤ProLuCID结果。假阳性率由程序根据匹配到诱饵数据库的光谱的数量和质量进行估计。我们专注于变形链球菌UA159编码的蛋白质，并比较了67小时与115小时的生物膜。混合菌种中蛋白质丰度的水平通过将光谱计数乘以混合菌种生物膜样品中变形链球菌CFU与总CFU的比值，以标准化到变形链球菌的相对数量来计算。
胞外多糖基质对变聚糖酶的敏感性
检查了混合菌种生物膜中形成的胞外多糖基质对变聚糖酶的敏感性，该酶来自哈茨木霉。该酶由William H. Bowen博士慷慨提供。如前所述，在sHA表面形成生物膜，并使用Alexa Fluor 647标记的葡聚糖偶联物标记胞外多糖基质。在生物膜发育91小时时，向培养基中加入变聚糖酶。在115小时时，取出生物膜并用SYTO 9标记细菌细胞。使用共聚焦荧光显微镜检查生物膜，并进行AMIRA/COMSTAT分析。
通过延时杀伤试验评估完整生物膜内的细胞活力
通过延时测量评估了氯己定对抗生素引入后立即对生物膜细胞活力的影响。将完整的生物膜（由亲本株UA159或 gtfBC 无效突变株形成）在0.89% NaCl中浸洗两次，然后转移到含有2.5 μM SYTO 9（用于标记活细胞）和2.5 μM碘化丙啶（用于标记死细胞）的4 ml 0.89% NaCl培养皿中，按照Hope和Wilson描述的标准方案在室温下孵育30分钟。标记后，使用配备25x水浸物镜的Olympus FV 1000双光子激光扫描显微镜获取共聚焦图像。激发波长设定为780 nm，SYTO 9的发射滤波器为495/540 OlyMPFC1滤波器，PI的发射滤波器为HQ655/40M-2P滤波器。在完成第一次扫描后，立即将48 μl 10%（v/v）CHX溶液小心加入到4 ml细胞培养皿中并混合，使CHX终浓度为0.12%（v/v）。CHX不与本研究中使用的染料反应。对于延时系列，在CHX暴露后15、30、45和60分钟拍摄相同视野的图像。使用COMSTAT量化每个系列共聚焦图像中活细菌和死细菌的总生物量。计算每个时间点活菌与总细菌的比例，并绘制活细胞的存活率。存活率是基于随时间变化的活细胞数量计算的。CHX引入前即刻的初始活细胞数被视为100%。然后测定CHX引入后每个时间点的活细胞数，并通过与初始时间点比较来确定存活百分比。因此，可以原位实时监测基质的结构组织对CHX杀灭效果的影响。
统计分析
进行探索性数据分析以确定最合适的统计检验；同时检查方差齐性和误差正态分布的假设。然后使用ANOVA分析数据，并使用F检验来检验各组之间的任何差异。当检测到显著差异时，使用Tukey-Kramer HSD方法对所有组进行两两比较以调整多重比较。还使用Pearson检验评估pH值与微菌落高度（或直径）之间的线性相关性。使用JMP 3.1版软件进行统计分析。显著性水平设定为5%。
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