1.5病毒生长曲线绘制
将第4代的细胞上清按照感染复数(MOI)大于1接种于原代羊睾丸细胞，于接种后8、16、24、36、48、72、96、120、144、168、192、216 h收取细胞上清，按照Reed-Muench法计算不同时间点细胞液上清TCID50值，将不同时间点的TCID50绘制曲线以观察分离毒株的增殖动态。
1.6电镜观察
取纯化后的病毒液灭活制备病毒悬液，将制备好的悬浮液样品，用吸管吸取，滴于带有支持膜的铜网上。根据悬液内样品的浓度，立即或放置数分钟后，用滤纸从液珠边缘吸去多余液体，滴上染液，染色时间30 s。用滤纸吸去染液，待干燥后通过透射电子显微镜观察病毒粒子形态。
1.7免疫荧光鉴定
分离第4代细胞上清接种于96孔板中的PLT细胞。待最高剂量病毒感染孔超过50%细胞出现CPE时，将96孔板浸泡于置于-20℃冰箱预冷的甲醇中，灭活病毒并固定细胞30 min。随后取出96孔板，显微镜下观察细胞，并用免疫荧光法检测病毒蛋白。一抗为本实验室保存的鼠抗LSDV P32蛋白单克隆抗体(1∶400稀释)，二抗为FITC标记的羊抗鼠IgG(1∶500稀释)，用健康小鼠血清作为阴性对照，倒置荧光显微镜进行观察、拍照。
1.8 GPCR基因的测序及分析
采用病毒基因组DNA/RNA提取试剂盒提取第4代细胞上清DNA，并使用引物GPCR-F/GPCR-R检测病毒(引物序列见表1)，回收目的基因，送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。利用生物信息学软件DNAStar7.0和MEGA6分析测得的GPCR基因序列，与其它分离毒株(见表2)使用MEGA7中的Clustal W对核苷酸进行比较比对及遗传进化分析并使用TVBOT进行美化。核苷酸相似性比对的百分比由DNASTAR(Lasergene Inc.，Madison，USA)的MegAlign程序生成。使用MEGA 7进行系统发育分析，并使用最适合数据集的模型构建最大似然树。系统发育关系的可靠性评价采用bootstrap分析与1 000个重复。
表2 LSDV参考分离株
2结果
2.1组织样本PCR检测
以组织样本提取的核酸为模板，采用P32蛋白编码基因特异性引物LSDV-F/LSDV-R进行PCR扩增，获得的片段大小约为192 bp，与预期片段大小相符，表明病牛组织样本中可能存在LSDV(如图1)。
MV.DL500 DNA相对分子质量标准；NC.阴性对照；PC.阳性对照；HLJ.Heilongjiang/2022株待检样本；JL.Jiling/2022株待检样本；JX.Jiangxi/2022株待检样本
图1病料中LSDV的PCR检测
2.2病毒细胞病变观察及TCID50的测定
将上述检测为阳性的组织样本液上清，接种PLT细胞，盲传到第4代出现CPE现象。PCR检测结果(图略)三株病毒第1、3、4代细胞培养物均为阳性。将分离出的3个LSDV毒株，分别命名为LSDV/Heilongjiang/2022株、LSDV/Jiling/2022株和LSDV/Jiangxi/2022株。取不同稀释度的3株病毒分别接种PLT细胞，计算病毒的TCID50，结果显示，LSDV/Heilongjiang/2022毒株的TCID50为1×106.0 TCID50·mL-1、LSDV/Jiling/2022毒株的TCID50为1×105.3 TCID50·mL-1，而LSDV/Jiangxi/2022毒株的TCID50为1×105.1 TCID50·mL-1。
2.3分离病毒的电镜观察
经透射电镜下观察，病毒粒子呈砖形或椭圆形(图2)。根据标尺使用Image J软件估算LSDV/Heilongjiang/2022株病毒平均大小约240 nm×280 nm、LSDV/Jiangxi/2022株病毒粒子平均大小约276 nm×245 nm、LSDV/Jiling/2022株病毒粒子平均大小约210 nm×200 nm。
图2 3株LSDV的透射电镜观察(50 000×)
2.4分离病毒的免疫荧光鉴定
间接免疫荧光试验可以观察到，3株分离病毒感染细胞呈现特异性黄绿色荧光，未接毒对照细胞无荧光，鉴定结果见图3。综合电镜观察、免疫荧光(IFA)鉴定与PCR检测结果可知，本试验成功从牛病变组织中分离到LSDV/Heilongjiang/2022株、LSDV/Jiling/2022株以及LSDV/Jiangxi/2022株。
A1、B1、C1.分别为接种LSDV/Jiling/2022、LSDV/Heilongjiang/2022以及LSDV/Jiangxi/2022试验组；A2、B2、C2.阴性对照组
图3 3株LSDV的间接免疫荧光检测(IFA)
2.5分离毒株的增殖动态测定
将Heilongjiang/2022株、LSDV/Jiling/2022株及LSDV/Jiangxi/2022株盲传至第4代的细胞上清分别接种于PLT细胞。接种后8 h，LSDV/Heilongjiang/2022株病毒滴度可达到102.8 TCID50·mL-1；接种96 h后，滴度最高，可达到106.0 TCID50·mL-1；接种120 h后，滴度开始下降，可达到105.7 TCID50·mL-1；接种216 h后，滴度为104.7 TCID50·mL-1(如图4a)。
a.LSDV/Heilongjiang/2022株的生长曲线；b.LSDV/Jiling/2022株的生长曲线；c.LSDV/Jiangxi/2022株的生长曲线
图4 3株LSDV的一步生长曲线
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