摘要
磷是植物生长发育必需的营养元素之一，然而植物从土壤中可获取的磷素十分有限，土壤中存在大量难利用的有机难降解磷，其中植酸(肌醇六磷酸)占据了较大部分。
目的利用植酸酶对植酸的高效水解能力，对黑土土著细菌进行植酸酶基因修饰，提高土壤有效磷含量。
方法利用锚定蛋白pGSA对细菌植酸酶AppA进行表面展示，以提高蛋白酶的稳定性和活性以及底物的接触效率。基于CRISPR靶向基因插入修饰技术，将表面展示的植酸酶融合蛋白基因靶向转座至一株从黑土分离的皮氏罗尔斯顿氏菌(Ralstonia pickettii)G3的基因组16S rRNA基因位点，以摆脱传统蛋白表达的载体依赖。
结果细菌16S rRNA基因可以作为基因修饰的通用靶点，并且不会对该菌的增殖产生明显影响。植酸酶基因修饰菌对植酸的水解能力提高了8倍以上，并且可以在较宽的pH范围内发挥作用。将该基因修饰菌施用于黑土后，土壤植酸酶活性明显提升，且速效磷含量提高了近30%。
结论植酸酶基因修饰的土著细菌能够促进土壤植酸水解，增加土壤有效磷含量，提高土壤磷素有效性。
土壤中生物可直接利用的磷通常较少，大部分磷以有机磷的形式存在(20%-80%)。低分子量磷酸单酯(如植酸、磷酸糖和核糖核苷酸)以及磷酸酯聚合物(如核酸和磷脂)，是土壤中有机磷的主要形式，其主要源于植物和微生物残体。黑土中，有机磷的占比通常在20%-60%之间，高有机质土壤中的有机磷含量甚至可占土壤总磷的50%以上，而植酸是有机磷的重要组成部分。植酸(肌醇六磷酸)是一种广泛存在于植物中的有机磷化合物，农田土壤中的植酸主要来源于植物残体分解、根系分泌物、有机肥以及微生物活动，其中植物残体和有机肥输入占比较高。在耕地土壤中，植酸占到土壤总磷的20%以上，每年在土壤中积累的植酸可达5 100万t，相当于约65%的磷肥施用量。因此，如何释放土壤中植酸的磷对于提高土壤有效磷具有重要意义。
可以水解植酸的酶有磷酸单酯酶、磷酸二酯酶和植酸酶，其中植酸酶可特异性高效催化植酸水解为肌醇和磷，进而提高土壤中溶解性磷含量。根据来源不同，植酸酶主要分为细菌植酸酶和植物植酸酶2类。目前研究报道的产植酸酶细菌超过100种，主要分布于大肠杆菌、芽孢杆菌属、假单胞菌属、乳酸菌属等；而植物植酸酶主要存在于种子(如小麦、玉米、大豆)中，用于种子萌发时释放储存的磷。植物植酸酶产量低、提取成本高，工业应用较少，主要依赖细菌来源的植酸酶。值得一提的是，细菌植酸酶比植物植酸酶具有更强的水解活力，且无须复杂的蛋白修饰，因此更加适用于土壤有机磷分解研究。研究表明，植酸酶添加可提高土壤有效磷含量1.18倍，且明显促进水稻生长。虽然目前已挖掘了许多解磷菌，但其解磷机制主要依赖分泌有机酸释放矿物中的无机磷，或通过磷酸酶水解结构简单的有机磷，通常对植酸的水解能力有限。利用微生物植酸酶构建基因工程植物促生菌，可以有效弥补减少磷肥使用后的缺口，提高土壤有效磷含量。大肠杆菌植酸酶AppA具有高效催化活性与广谱适应性，在pH 2.0-7.5范围内均可高效水解植酸，同时耐受60-70℃高温，此外AppA还展现出强抗逆性、易于异源表达，且在复杂基质中保持高底物亲和力，因此细菌植酸酶AppA是植酸活化研究的重要蛋白酶之一。
目前，植物促生菌在农业系统中发挥了重要作用，可在一定程度上替代部分传统农用化学品，提高粮食产量。然而，虽然从土壤中分离并驯化了一些植物促生菌，但这些促生菌的遗传信息不明确，且通常进化出与农业种植不协调的遗传调控模式，同时复杂的土壤环境也会干扰其促生作用，这极大限制了植物促生菌的实际应用。相比之下，氮固定、磷释放、纤维素分解、植物免疫诱导等相关的微生物促生机制和基因已被广泛研究和报道，为开发农业促产的基因工程菌提供了巨大潜力。随着全球对转基因技术的逐步放开和接受，为农业系统设计相匹配的土壤元素活化和植物促生工程菌将是未来趋势之一。
向导RNA辅助的靶向转座元件插入系统INTEGRATE(insertion of transposable elements by guide RNA-assisted targeting)是2019年报道的一种优秀的细菌基因编辑CRISPR工具，其可以实现长达10 kb碱基的准确、高效、无标记的基因组整合。这种可编程整合酶系统克服了现有整合子系统的一些重要弊端，例如效率低、依赖重组、需要多个载体辅助、靶点位置固定等。然而，该系统在功能基因移植以及通用编辑靶点挖掘等方面的研究较少。此外，另一种微生物技术是针对细菌膜蛋白的改造。细菌表面展示技术是一种对细菌细胞外膜蛋白的改造技术，通过将靶蛋白的N端或C端与锚定蛋白融合，进而将感兴趣的蛋白质或酶直接固定在微生物细胞表面上，使目的蛋白定位于宿主细胞表面发挥功能，这一方面可以规避酶的裂解释放过程，减少传质限制，同时可保证酶的活力以及稳定性。相关研究表明，表面展示后的蛋白酶可以提高其在土壤环境中的稳定性，并延长其作用时间，进而充分发挥酶在环境中的作用。
基因修饰是指通过生物技术手段人为改变生物体的基因组，包括插入、删除或修改特定基因，以改变其性状或功能。本研究针对黑土中植酸的水解，提出了基于INTEGRATE靶向转座技术，利用细菌植酸酶基因appA对土著微生物进行基因插入修饰，并通过表面展示技术进一步发挥植酸酶的作用，旨在实现水解黑土植酸并提高有效磷含量。其中，该研究的关键技术包括INTEGRATE转座插入、表面展示的融合蛋白构建、目的基因的功能表达等。本研究对构建好的植酸酶基因修饰菌的酶活进行检测，并将其施用于黑土土壤，以期为黑土保护提供新的微生物策略，也为基因工程菌的构建提供新的思路。
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