材料与方法
酵母菌株和生长条件
本研究中使用的酵母菌株列于补充表S1。用于SGA分析的酵母条件温度敏感必需基因集合由Charles Boone教授提供。酵母细胞在YPD或合成缺陷培养基中生长，并按指示添加抗生素。
使用条件温度敏感必需基因集合进行SIR2合成遗传阵列分析 SIR2（ts）SGA分析按描述以重复方式进行。筛选以1536点格式使用SINGER ROTOR HDA机器人进行。具有最高统计学概率为真实相互作用的命中通过微培养实验在30、34和38°C下以三重复确认，使用Bioscreen C系统。每30分钟测量一次光密度，持续72小时。生长速率的LSC（对数菌株系数）值按描述计算和评分。热图使用TreeView制作，Osprey 1.2.0用于SIR2必需基因网络分析。SGA命中之间的物理相互作用基于BioGRID相互作用数据库获得。
荧光显微镜
使用蔡司Axiovert 200 M荧光显微镜获取图像，使用GFP、Cy3和DAPI通道。所有去卷积图像均使用ImageJ插件"Iterative deconvolve 3-D"。
HttQ103-GFP表达和聚集体滞留效率测定 含有pYES2-HttQ103-GFP质粒的细胞在30°C下在YNB-URA 2%棉子糖中生长至指数期（OD600约0.5）。通过添加半乳糖至终浓度2%诱导Htt103Q-GFP表达。在30°C下4小时后，洗涤细胞并重悬于1.5 ml缓冲液P（10 mM NaH2PO4，150 mM NaCl，2%半乳糖；pH 7.2）中。在Htt103Q-GFP表达期间存在的所有细胞通过用0.2 mg/ml刀豆球蛋白A Alexa Fluor 647（Invitrogen）染色细胞壁组分α-甘露吡喃糖基和α-葡吡喃糖基30分钟进行标记。然后将细胞在缓冲液P中洗涤，重悬于含2%葡萄糖的YNB-URA中（这将关闭Htt103Q-GFP表达），并在30°C下生长一个出芽事件。这使得能够区分在Htt103Q-GFP表达期间存在的刀豆球蛋白A染色子细胞和在Htt103Q-GFP表达后产生的子细胞。细胞在3.7%甲醛中固定，并使用荧光显微镜分析聚集体的分离。ts等位基因的分离测定以相同方式进行，但不进行刀豆球蛋白A染色。细胞在22°C下生长至指数期，然后在不同温度下进行诱导和出芽（sec18-1和sec53-6为26°C，cmd1-1为28°C，myo2-14为32°C）。
使用刀豆球蛋白A染色的热诱导聚集体滞留和清除测定 滞留效率测定按描述进行，在热休克处理前进行刀豆球蛋白A染色（如上所述）。通过图像分析区分聚集体滞留和清除。滞留确定为热休克处理后从含聚集体母细胞产生的总出芽数中含聚集体的出芽百分比（不含conA的出芽）；清除效率确定为热休克前已存在的总出芽数中不含聚集体的出芽百分比（即用conA染色的）。每个菌株定量超过300个出芽事件。
聚集体分离作为世代时间函数的统计分析 所有统计计算在R-3.0.0中进行。进行回归分析，表明在p<0.05时没有统计学显著差异，以检验"相对世代时间"和"不对称偏差"之间是否存在相关性。
mHtt103Q稳定性测定 通过向在对数中期（OD600 = 0.5）在含2%棉子糖培养基中生长的酵母细胞中添加半乳糖诱导mHtt103Q-GFP蛋白的体内表达。在诱导3小时后向培养物中添加10 mg/ml放线菌酮（CHX）以停止翻译。细胞继续在30°C下振荡培养。然后在添加CHX后0、1、2、3、4和12小时取样并固定。每个样品的GFP信号强度通过流式细胞术（FACS Aria，BD设备）定量。每个样品计数10000个事件。基于未诱导对照选择截止值。稳定性测量为添加CHX抑制蛋白质合成后Htt103Q-GFP聚集体的平均信号强度随时间的变化。
通过放线菌酮增加世代时间后的聚集体遗传 含有pYES2-HttQ103-GFP质粒的细胞在30°C下在SC-URA + 2%棉子糖中生长至OD600约0.5。通过添加2%半乳糖在30°C下诱导Htt103Q-GFP表达4小时。然后按上述方法用ConA染色细胞。细胞密度调整至OD600 = 0.5。细胞分为3组，在30°C下恢复不同时间，直到细胞生长至与不同浓度放线菌酮处理的未处理对照相同的光密度值。在出芽形成期间通过向培养基中添加2%葡萄糖进一步抑制HttQ103-GFP表达。放线菌酮处理如下进行：在未处理组中，出芽期间不添加放线菌酮，细胞在30°C下恢复4小时，让细胞产生新出芽并生长至OD600达到0.8。在两个放线菌酮处理组中，向细胞培养物中添加0.05或0.1 mg/ml放线菌酮，并在30°C下生长至OD600达到与未处理对照组相同的值（0.8）。然后将细胞在3.7%甲醛中固定，并使用蔡司荧光显微镜分析新产生出芽的出芽事件的聚集体遗传。
蛋白质印迹
收集OD600 = 0.7的20 ml酵母细胞，热休克和恢复后重悬于800 ml 0.1 M NaOH中5分钟（室温），然后离心。将细胞在125 ml裂解缓冲液（50 mM Tris，pH 7.4，5 mM EDTA，5 mM NEM，1% SDS）中加蛋白酶抑制剂（Roche，11697498001）煮沸3分钟。将上清液与等量laemmli缓冲液混合，在95°C下加热3分钟。变性蛋白加载到NuPAGE Novex 10% Bis-Tris凝胶（Invitrogen，NP0315BOX）上，并转移到PVDF膜上进行蛋白质印迹。本研究使用抗GFP抗体（Roche，11814460001）和pGK（Invitrogen，459250，作为上样对照）。蛋白质印迹后，用Odyssey红外成像系统扫描膜，并用Odyssey 2.1软件定量。倍数比基于三个生物学重复实验计算。
溶解度测定
溶解度测定按描述进行。每个样品的相同体积蛋白溶液加载到预制SDS-PAGE凝胶（Life Technologies）上。对于热诱导聚集体测试，凝胶然后用考马斯亮蓝染色，并用GS-800校准密度计（BioRad）扫描。对于表达Htt-103Q-GFP的细胞，通过蛋白质印迹用小鼠抗GFP单克隆抗体（Roche）检测Htt-103Q-GFP蛋白。然后用ImageJ软件定量扫描的凝胶和蛋白质印迹膜。然后计算和绘制每个测试菌株的可溶和聚集蛋白的相对比率。
硫黄素T染色
淀粉样蛋白的硫黄素T染色按描述的方案进行，略有改动。细胞在50 mM KPO4（pH 6.5）、1 mM MgCl2、4%甲醛中固定10分钟，然后用PM缓冲液[0.1 M KPO4（pH 7.5），1 mM MgCl2]洗涤三次，并重悬于PMST [0.1 M KPO4（pH 7.5），1 mM MgCl2，1 M山梨醇，0.1% Tween 20]中。细胞在0.6% β-巯基乙醇存在下用0.125 mg/ml Zymolase在室温下处理15分钟。原生质球细胞洗涤一次，然后重悬于PMST中，用0.001%硫黄素T在室温下染色20分钟。用PMST洗涤五次后，在蔡司Observer Z1显微镜的CFP通道下观察细胞染色。
Hsp104-Y662A-mCherry聚集体诱导中期对数期细胞（OD = 0.5）在42°C下孵育10分钟，然后在30°C下孵育30分钟。然后将这些细胞用3.7%甲醛固定，用PBS（pH 7.4）洗涤两次，并储存用于显微镜观察。
共定位和聚集体形态定量
分析至少100个具有可见结构（由GFP标记蛋白形成）和红色聚集体（由Hsp104-Y662A-mCherry或Htt103Q-mRFP形成）的细胞。其中，具有任何重叠的绿色和红色信号的细胞被视为共定位细胞，然后计算其百分比。Z堆栈图像用于聚集体形态定量，定量超过100个显示聚集体的细胞。根据细胞中聚集体数量将细胞分为3类（1类，具有1个聚集体的细胞；2类，具有2个聚集体的细胞；3类，具有3个或更多聚集体的细胞）。在所有Z堆栈中计数聚集体。
肌动蛋白去极化分析
肌动蛋白去极化按描述定量。计算所有具有小或中等出芽的出芽事件中母细胞中肌动蛋白斑点的数量。计数具有超过6个肌动蛋白斑点的母细胞，并计算它们占所有母细胞的百分比并绘图。
超分辨率三维结构照明显微镜（3D-SIM） 携带Hsp104Y662A-mCherry的细胞在42°C下孵育10分钟，然后在30°C下孵育10-20分钟。携带Htt103Q-GFP的细胞通过添加2%半乳糖在30°C下诱导4小时。然后将细胞用3.7%甲醛固定，用PBS（pH 7.4）洗涤两次。肌动蛋白细胞骨架使用Alexa Fluor 568鬼笔环肽（Invitrogen，A12380）按手册染色。同时表达Abp140-3GFP和Hsp104Y662A-mCherry的细胞按上述进行热处理。对于超分辨率三维结构照明显微镜，使用蔡司的ELYRA PS.1 LSM780装置。使用100x/1.46 Plan-Apochromat油浸物镜，激发光波长为488 nm和561 nm，获取蛋白聚集体（Hsp104Y662A-GFP）和肌动蛋白细胞骨架（Alexa fluor 568鬼笔环肽或Abp140-3GFP）的3D-SIM图像。使用100 nm间隔的Z堆栈在3D-SIM中扫描整个酵母。使用Zen2011软件进行采集、超分辨率处理和计算以及3D重建。使用多色珠对ELYRA系统进行x、y和z方向的色差校正，并相应检查和校准所有获得的图像。
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