细胞复苏是指将冻存在液氮或低温冰箱中的细胞解冻后重新培养,使其恢复生长的过程。细胞复苏过程中,需要遵循快速融化的原则,这样可以保证细胞外结晶短时间内融化,避免由于缓慢融化使水分渗入细胞内再形成冰晶对细胞造成损伤。细胞复苏后1-2天,细胞活性会逐渐得到恢复(如图1为复苏HEK293T细胞数对数值)。
细胞复苏的主要实验过程如下:
步骤1:从液氮容器或低温冰箱中取出冻存管,迅速将其浸入37℃的温水中,并不时摇动以使其尽快融化。37℃水浴时间尽可能短(1-2min),因为延长时间会增加细胞死亡率;
步骤2:当细胞完全融化后,从水浴中取出冻存管,用酒精棉球消毒外部,然后开启瓶盖;
步骤3:将细胞悬液转移到离心管中,加入适量的培养液,并进行离心,以去除DMSO和死细胞;
步骤4:离心后,弃去上清液,用新的培养液重悬细胞,并计数,调整细胞密度;
步骤5:将细胞接种到培养瓶中,37℃静置培养。在培养初期,应注意观察细胞状态,以确保其正常生长。
图1.HEK-293T细胞生长曲线(复苏后)
图2.细胞复苏操作流程图
细胞复苏注意事项
1.注意无菌操作,避免细胞污染,可使用支原体去除喷雾剂提前对实验室环境,培养箱进行处理;
2.融化细胞时,温度和时间应严格控制,以避免对细胞造成损伤;
3.在细胞接种后,应定期观察细胞生长情况,疑似支原体污染时可使用可视化LAMP支原体检测试剂盒检测,若发生支原体污染,可使用支原体去除试剂及时处理。