大蜡螟感染模型
通过用10^7个酵母细胞攻击幼虫进行大蜡螟幼虫的体内实验。与对照组相比，接种酵母的幼虫出现色素沉着增强（图4A）。获得了3个独立实验的生存曲线。与对照组相比，所有分离株都降低了幼虫的存活率，但注射分离株5的幼虫存活率降低始终显著高于其他组。图4B显示了3个实验合并数据的生存曲线，其中分离株5的中位生存期为7天，而其他分离株为9-11天。未感染对照组的中位生存期为14天。我们还用10^4和10^6个酵母进行了实验，但在这些接种量下，幼虫的存活率与未感染对照组相似（数据未显示）。
感染后第3天和第6天，真菌负荷没有显著差异。感染后第6天获得的CFU范围从分离株4的1.4 x 10^7到分离株1的8.2 x 10^7。
推定毒力因子
由于我们发现分离株5在大蜡螟中的毒力与其他分离株不同，我们评估了与毒力相关的因素是否可以解释这种变化的原因。所有5株分离株在37°C的Christensen尿素肉汤中培养4天和7天后脲酶产生均为阳性，在559 nm处的平均吸光度没有差异。通过测量琼脂上azoalbumin降解晕圈确定的蛋白酶活性范围在0.6到0.76之间，分离株1的活性最高（p/z=0.6）。该活性与分离株2和分离株4有显著差异。通过DHN-黑色素干重/酵母干重比值获得的分离株产生的DHN-黑色素比例没有统计学差异。所有分离株在35°C和37°C下生长，在39°C下均不生长。此外，分离株在BHI培养基中的生长曲线相似，它们之间没有统计学差异（图5）。
关于对氧衍生物种的敏感性，分离株2在暴露4小时时生长抑制最高，与分离株3和分离株4有显著差异（图6A）。其他时间点的差异不显著。暴露于活性氮中间体降低了分离株的存活率，但分离株5的存活率在所有检查时间点始终高于其他分离株。然而，这些差异并不显著（图6B）。
药敏试验
所有分离株对抗真菌药物的敏感性相似，特比萘芬的MIC为0.06μg/mL，伊曲康唑为1.0μg/mL，酮康唑和两性霉素B为2.0μg/mL，伏立康唑为≥8.0μg/mL。
讨论
我们的研究重点在于表征该患者体内连续分离的分离株，因为他在11年期间患有孢子丝菌病，具有临床侵袭性和治疗困难，并播散到皮肤和骨骼。我们必须指出，由于农村地区距离医疗诊所较远、即使像碘化钾这样廉价的药物也费用高昂以及不愿接触医疗系统等原因，在某些巴西人群中，缺乏前期治疗的情况不幸地很常见。尽管患有糖尿病和高血压，该患者先前是健康的，这表现在他能够在砌砖工这种体力压力大的条件下积极工作，并且为寻找可能的潜在免疫抑制状况而进行的测试未显示异常。初始T细胞的减少可能与慢性感染引起的淋巴细胞持续刺激，诱导其分化有关。
考虑到该患者疾病的慢性和复发性，我们考虑了以下可能性：1)他可能被不同物种或菌株再感染，或2)感染菌株的毒力随时间发生了变化。然而，我们确认每个分离株都是巴西利亚孢子丝菌。虽然不具决定性，但分离株在指纹图谱PCR中的条带模式没有差异（图2）表明它们是相同的；然而，这并不能排除随着时间的推移被同一菌株再感染，而不是慢性疾病的复发。
分离株5的几丁质合成酶编码基因中的多态性表明几丁质合成酶基因发生了改变，这可能通过影响几丁质合成和细胞壁结构来增加毒力。几丁质是真菌细胞壁和隔膜的重要组成部分，存在于所有已知的致病真菌中，但不存在于人类中。毒力决定因素包括宿主识别和入侵所需因子以及保护宿主防御系统的因子。由于细胞壁参与这些过程，它保护真菌细胞免受外部损伤，调节宿主细胞对细胞壁成分的粘附，并因此介导免疫反应。因此，细胞壁结构及其组成的任何变化都可能影响真菌毒力。迄今为止，几丁质已与其他真菌（如巴西副球孢子菌、荚膜组织胞浆菌和皮炎芽生菌）的毒力相关。几丁质沉积可能影响黑色素化，这是病原性真菌（包括孢子丝菌）中与细胞壁和毒力相关的另一个重要因素。因此，几丁质的改变可能导致毒力的改变。
我们的体外巨噬细胞实验未显示患者分离株之间的毒力差异：巨噬细胞有效地吞噬了酵母，但一旦摄入后无法杀死它们。然而，我们使用大蜡螟幼虫的体内实验一致地显示，接种分离株5（在INI随访5年后获得，即疾病总病程11年后）的幼虫死亡率显著更高，这强烈表明该分离株的毒力发生了变化。应该指出的是，大蜡螟模型已成功用于其他真菌和细菌，本研究是其在巴西利亚孢子丝菌中的首次使用。大蜡螟模型与啮齿动物系统相比具有优势，例如成本低、易于储存和处理以及更有利的伦理方面。
测定脲酶和DHN-黑色素以及我们对耐热性的评估显示分离株之间没有差异。蛋白酶活性不一致，但分离株1测得的较高活性与所有其他分离株相比并不一致，并且似乎并未导致该分离株毒力增加，毒力实验证明了这一点。所有分离株的抗真菌药物敏感性相似。将我们患者菌株中发现的MIC与先前发表的里约热内卢孢子丝菌属和巴西利亚孢子丝菌的药敏谱进行比较，特比萘芬对分离株产生了最佳的体外疗效，而唑类和两性霉素B分别具有较差和中等的MIC结果。值得注意的是，尽管特比萘芬的MIC较低，但该药物在几年治疗该患者的过程中仅取得中等成功。
最后，评估对氧化应激敏感性的测试显示，分离株对活性氮中间体的敏感性高于对氧衍生物种。值得注意的是，分离株5对活性氮中间体的抵抗力最强。抵抗类似于巨噬细胞内溶酶体中存在的不利条件的能力可能解释了该分离株毒力较高的原因；然而，我们的结果不能完全得出这一结论。尽管如此，这一发现可能部分促进了该分离株的较高毒力。
由于患者自发病以来已退休，远离他可能获得感染的环境，我们的数据表明，合理地得出结论他一直是慢性感染。此外，将这些患者分离株鉴定为巴西利亚孢子丝菌有些令人惊讶，因为我们没有发现与猫接触的流行病学联系，并且患者居住在里约热内卢孢子丝菌病"带状"区域之外的直辖市。
我们的数据支持这样的结论：该患者在11年期间感染了相同的真菌。尽管其对特比萘芬体外敏感，但巴西利亚孢子丝菌菌株通过逃避他的免疫系统反应有效地留在了患者体内。此外，大蜡螟研究表明，在该患者的疾病过程中毒力发生了演变。我们怀疑寄生虫-宿主关系中存在其他未在此研究的方面，促成了这种毒力增加，需要进一步研究来阐明这些因素。我们认为这项体内和体外研究是独特的，因为它证明了巴西利亚孢子丝菌在患有慢性和播散性孢子丝菌病的宿主体内毒力的演变。
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