摘要液化沙雷氏菌是畜产食品在低温贮藏中的一种常见致腐菌和食源性病原菌。该实验通过最小抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)和生长曲线分析植物乳杆菌SCB2505代谢物对液化沙雷氏菌的抑菌活性,并通过高温、过氧化氢酶及蛋白酶、pH处理和乳酸排除实验分析抑菌物质组成,再通过生物被膜抑制率、细胞壁和细胞膜完整性、菌体形态变化的研究来分析其抑菌机理。结果表明,植物乳杆菌SCB2505代谢物对液化沙雷氏菌的MIC为8 mg/mL,其抑菌物质的高温耐受性较好,pH越低其抑菌效果越好,但相同pH的乳酸溶液不具有抑菌活性,过氧化氢酶和蛋白酶对其抑菌圈大小有显著影响,推测抑菌物质可能为乳酸盐、细菌素与过氧化氢的复合物。植物乳杆菌SCB2505代谢物能明显抑制液化沙雷氏菌生物被膜合成,破坏细胞壁和细胞膜的完整性,使得菌体皱缩凹陷,甚至裂解死亡。该研究结果说明植物乳杆菌SCB2505代谢物作为天然防腐剂在动物食品防腐领域具有较好的应用前景。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是常见的益生菌,存在于各种传统发酵食品中,具有改善肠道健康[1]、抑制有害菌生长等益生作用。植物乳杆菌代谢物是由植物乳杆菌生长过程中产生的代谢物质,包括有机酸[2]、脂肪酸[3]、细菌素[4]等多种抑菌物质,对腐败菌具有较强的抑菌活性。目前,关于植物乳杆菌代谢物的抑菌机制研究较少,WANG等[5]基于代谢组学研究了植物乳杆菌无细胞上清液对嗜水气单胞菌的抑菌机理,证明植物乳杆菌无细胞上清液能够影响嗜水气单胞菌的三羧酸循环、氨基酸代谢、碳水化合物代谢和核苷酸代谢,并破坏细胞膜完整性,有效抑制指示菌生长,但是其并未对上清液中的有效抑菌成分进行分析。现阶段大部分研究认为植物乳杆菌的抑菌活性主要来自于细菌素,并以细菌素为主要研究对象,例如plantaricin LP 21-2[6]、plantaricin DL3[7]等新型细菌素对革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌和真菌具有广谱抑菌活性,高热稳定性,能够作用于细菌特定位点使得细菌表面产生孔洞,引起胞内物质泄漏,从而杀死细菌。
液化沙雷氏菌(Serratia liquefaciens)属于肠杆菌科、沙雷氏菌属,是一种在冷藏食品中常见的腐败菌,存在于各种冷冻蔬菜和肉制品中,引起食品腐败变质[8-9]。液化沙雷氏菌属于条件致病菌,能够导致人体食物中毒。液化沙雷氏菌在低温食品中具有较强的致腐能力,MACHADO等[10-12]发现液化沙雷氏菌能够产生耐热蛋白酶和脂肪酶,引起生乳腐败,是冷生乳的主要腐败菌,也能导致冰鲜鸡肉表面产生黏液,引起冰鲜鸡肉腐败[13]。目前,MATAMOROS等[14]用嗜冷乳酸菌作为抑制剂评价其对液化沙雷氏菌的抑菌性能,发现乳球菌属、明串珠菌属和部分乳杆菌对液化沙雷氏菌有抑菌活性,但并未进行抑菌机制的探究。
本实验基于前期筛选得到的一株拮抗液化沙雷氏菌SCB2649菌株生长的专利菌株植物乳杆菌SCB2505,提取其代谢物,通过测定其对液化沙雷氏菌SCB2649菌株的抑菌活性及其对细胞壁与细胞膜完整性、生物被膜及菌体结构等的影响,探究植物乳杆菌SCB2505代谢物的抑菌成分及其对液化沙雷氏菌SCB2649菌株的作用机理,为其在畜产食品防腐中的应用奠定基础。
1材料与方法
1.1材料与试剂
指示菌为液化沙雷氏菌SCB2649菌株,分离自味燃食品(深圳)有限公司提供的熟成牛肉中,由华南农业大学食品学院发酵工程团队保藏;植物乳杆菌SCB2505分离自开菲尔粒(西伯利亚地区),由华南农业大学食品学院发酵工程团队保藏。
碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,AKP)试剂盒、乳酸(lactic acid,LD)测试盒,南京建成生物工程研究所;胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)培养基、MRS培养基、LB琼脂培养基、碘化丙啶(PI),广东环凯微生物科技有限公司;结晶紫,天津市大茂化学试剂厂;无水乙醇、甲醇(分析纯)。
1.2仪器与设备
全自动生长曲线分析仪,芬兰Bioscreen公司;冷冻干燥机,德国Christ公司;光栅型酶标仪,美国Melecular Devices公司;倒置荧光显微镜,德国Carl Zeiss公司;冷冻高速离心机,德国Eppendorf公司;生化培养箱,韶关市泰宏医疗器械有限公司;高压灭菌锅,日本HIRAYAMA公司;场发射扫描电子显微镜,美国FEI公司。
1.3实验方法
1.3.1 SCB2505代谢物的制备
将菌株SCB2505经MRS液体培养基中经活化2～3代后,以接种量2%接种于MRS液体培养基中,30℃培养16～18 h,后在4℃下,以5 000 r/min离心10 min,经0.22μm无菌滤膜过滤,收集滤液,冻干。
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