我们的结果在线虫模型中未显示植物有益菌株有任何毒性或致病性迹象,仅显示两种临床菌株(ATCC 27155和EM22cb)有一些证据。大多数泛菌属菌株的细胞对植物寄生线虫爪哇根结线虫的存活没有影响,只有临床菌株EM22cb杀死J2幼虫的程度接近杀线虫剂对照(图3)。
图3. 临床菌株(黑色柱)和植物益生菌株(白色柱)的Pantoea菌细胞(上图)及无细胞培养上清液(下图)对植物寄生线虫Meloidogyne javanica(J2阶段幼虫)存活率的影响,与化学杀线虫剂Vydate P(虚线柱)的对比。误差线表示均值的95%置信区间。根据Waller-Duncan检验,标有相同字母的存活率柱状图无显著差异(P<0.05)。
该菌株对以细菌为食的线虫秀丽隐杆线虫的致病性与沙门氏菌ATCC 4594相似(图4)。除了泛藻凝集菌ATCC 27155的细胞也能有效杀死秀丽隐杆线虫外,其余菌株在任一模型中对线虫存活均无显著影响(图3和图4)。
图4. 临床Pantoea菌株细胞存在下秀丽隐杆线虫SS104(成虫期)温度不育突变体的存活情况:ATCC 27155(上实心三角)、EM13cb(下实心三角)、EM17cb(实心圆)、EM22cb(实心方形)、CIP A181(实心菱形)、VA21971(实心六边形),植物有益菌株CPA-2(上空心三角)、EPS125(下空心三角)、C9-1(空心圆)、P10c(空心方形)、Eh252(空心菱形)和Eh1087(空心六边形),与作为饲喂菌株的大肠杆菌OP50(带x圆圈)及对哺乳动物致病的沙门氏菌4594(x)对比。误差棒表示根据Waller-Duncan检验的最小显著差异。
临床或生物防治菌株的无细胞培养上清液对秀丽隐杆线虫的存活也没有影响(数据未显示),而大多数生物防治菌株的无细胞培养上清液对爪哇根结线虫有抑制作用。请注意,只有临床菌株ATCC 27155(其细胞显示对秀丽隐杆线虫有致病性)的无细胞培养上清液也对爪哇根结线虫有不良影响。因此,我们得出结论,临床菌株EM22cb和ATCC 27155在所研究的两种线虫模型中表现出不良效应。
线虫测定被广泛接受作为研究细菌毒力机制和识别有毒化合物的简单模型。虽然最常用的是秀丽隐杆线虫,但根结线虫属也对多种细菌的感染和杀死敏感,包括其他肠杆菌科细菌如阴沟肠杆菌。一些泛藻凝集菌株产生的有助于其生物防治活性的抗菌化合物可能是无细胞培养上清液对植物寄生线虫产生不良影响的一个因素,这在我们研究中观察到。菌株Eh252、Eh318和泛菌属vagans种C9-1产生抗生素pantocin A,菌株Eh318也产生抗生素pantocin B。植物有益菌株中存在pantocin A生物合成基因paaABC,但临床菌株EM22cb中缺失。另一种抗菌肽herbicolin I由植物有益菌株C9-1产生。
据报道,植物有益菌株Eh1087产生吩嗪,该菌株也对爪哇根结线虫的存活有不良影响。III型分泌系统基因hrcN是对抗真核生物细菌毒力的一个重要因子,存在于临床菌株VA2197中,但在线虫测定中最致命的临床菌株EM22cb中缺失。然而,应该指出的是,泛藻凝集菌中存在的T3SS在系统发育上更类似于假单胞菌属生物防治菌株中存在的T3SS,而不是动物病原体中存在的Inv/Spa系统。
本研究中使用两种线虫模型获得的数据与报道的生物防治菌株泛菌属vagans种C9-1和泛藻凝集菌E325、CPA-2和EPS125的致死口服剂量一致,这些剂量在Sprague-Dawley CD大鼠中超过了10^8-10^10 CFU/kg动物体重。相应地,美国环境保护署基于几项毒理学测试,已注册了含有菌株C9-1和E325的两种商业生物农药,将这些菌株标记为毒性类别IV(即“实际无毒”)。
与化脓性链球菌ATCC 19915阳性对照相比,在液体或琼脂培养中进行的红细胞测定中,没有任何植物有益或临床泛菌属菌株具有显著的溶血活性。在血琼脂上,观察到透明晕圈,并且在液体测定中,使用绵羊血和马血时,上清液的溶血百分比约为蜂毒肽溶血的60-65%(图5)。
图5. 临床菌株(左侧柱状图)和植物益生菌株(右侧柱状图)的Pantoea溶血活性与参照溶血性化脓链球菌菌株的对比。该检测使用Pantoea菌株的细胞及无细胞培养上清液,分别与绵羊血液(上图)和马血液(下图)进行反应。溶血误差条代表平均值的95%置信区间。
在艾姆斯试验中,无论是临床还是植物有益泛菌属菌株的无细胞培养上清液,对TA98和TA100菌株均未显示遗传毒性(图6)。
图6. Pantoea菌株无细胞培养上清液的遗传毒性(艾姆斯试验)与诱变剂对比。采用沙门氏菌突变株TA100和TA98作为指示菌株。使用1.25(LC)和2.5(HC)μM的叠氮化钠作为TA100菌株的诱变剂,2.5(LC)和5.0(HC)μM的2-硝基芴作为TA98菌株的诱变剂。
总之,基于溶血或遗传毒性测试,临床泛菌属菌株与植物有益菌株无法区分。然而,植物模型允许区分植物有益菌株和临床菌株。虽然线虫模型提供了两种临床菌株(ATCC 27155, EM22cb)不良效应的证据,但在植物有益菌株泛藻凝集菌和泛菌属vagans种C9-1中未观察到负面效应。最后,没有证据表明任何测试的植物有益或临床菌株具有毒性。
相关新闻推荐
1、噬菌体ΦSboM-AG3的一步生长曲线、形态、宿主范围测定
2、化合物C6对鼠诺如病毒和李斯特菌的抗感染活性及细菌生长动力学分析(一)
3、生长曲线分析仪解析希瓦氏菌呼吸性硝酸盐铵化途径的遗传与生理机制(一)
