研究简介
金黄色葡萄球菌感染，尤其是由多重耐药菌株引起的感染以及与生物被膜形成相关的感染，在临床实践中构成了重大的治疗挑战。本研究的目的是评估莫克拉维莫德（mocravimod，KRP-203）——一种经FDA批准的S1P受体调节剂——对临床分离的金黄色葡萄球菌的抗菌和抗生物被膜活性，并探讨其潜在的作用机制。通过最低抑菌浓度测定、时间-杀菌曲线实验和生物被膜抑制模型，评估了KRP-203对甲氧西林敏感金黄色葡萄球菌（MSSA）和耐甲氧西林金黄色葡萄球菌（MRSA）的抗菌活性。KRP-203对浮游状态的MSSA和MRSA均表现出强效的杀菌活性，MIC值范围为6.25–50 μM。时间-杀菌曲线实验显示，在8倍MIC浓度下，2小时内即可快速杀灭细菌，其杀菌动力学优于万古霉素。在亚抑制浓度下，KRP-203可抑制高达70%的生物被膜形成，并将成熟生物被膜中的活菌数减少超过2.5个对数级。为了阐明其抗菌机制，研究者进行了全基因组测序和定量蛋白质组学分析。这些分析揭示了膜相关基因（包括glnQ和BCAT）的突变，以及涉及膜完整性和氧化还原调控的蛋白质发生了显著变化。与此一致的是，功能性实验证实KRP-203能够破坏细菌细胞膜，表现为剂量依赖性的膜去极化、通透性增加，以及直接与心磷脂和磷脂酰甘油结合。分子对接进一步预测了KRP-203与GlnQ之间存在有利的相互作用。KRP-203对金黄色葡萄球菌显示出显著的抗菌和抗生物被膜活性，其作用机制很可能与破坏膜完整性有关。尽管这些发现凸显了其作为老药新用抗菌剂的潜力，但仍需进一步研究来全面阐明其分子靶点、优化抗菌效力，并评估其在体内的安全性。
Bioscreen 全自动生长曲线分析仪的应用
Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪被用于评估KRP-203对金黄色葡萄球菌浮游生长的影响。首先将金黄色葡萄球菌标准株SA113和临床株CHS101过夜培养后按1:1000比例接入新鲜TSB培养基中。然后将KRP-203通过二倍系列稀释法配制成不同浓度，使终浓度范围覆盖1× MIC至1/16× MIC，同时设置不加药的TSB孔作为生长对照。接着在Bioscreen C专用的蜂窝微孔板中每孔加入总体积200 μL的菌液与药液等体积混合物，每个条件设置3个复孔。随后将微孔板放入Bioscreen C设备中，设定检测波长为OD₆₀₀，培养温度为37℃，每隔1小时自动读取一次吸光度值，总监测时长为16小时，培养期间设备自带间歇振荡以防止菌体沉降；最后仪器自动输出各孔的OD₆₀₀-时间生长曲线。基于此实验，研究得出结论。1× MIC浓度的KRP-203可完全抑制SA113和CHS101的浮游生长，而1/2× MIC虽能延缓细菌生长，但在16小时后细菌仍会恢复增殖，从而明确了KRP-203对金黄色葡萄球菌的浓度依赖性杀菌边界。
实验结果
KRP-203对临床分离的金黄色葡萄球菌（包括甲氧西林敏感株MSSA和耐甲氧西林株MRSA）及其他革兰阳性菌均表现出广谱抗菌活性，MIC范围为6.25–50 μM；在8倍MIC浓度下，2小时内即可完全清除浮游细菌，杀菌速度显著快于传统抗生素万古霉素。在亚抑制浓度下，该药可抑制高达约70%的生物被膜形成，并对成熟生物被膜中的活菌实现超过2.5个对数级的清除。其作用机制是通过引起细菌细胞膜去极化、增加膜通透性，并与膜上关键脂质成分心磷脂和磷脂酰甘油直接结合，从而破坏膜完整性导致细菌死亡。全基因组测序发现耐药菌株中膜相关基因glnQ和BCAT发生突变，蛋白质组学分析则显示KRP-203处理会显著下调穿孔毒素HlgC的表达，削弱细菌致病性。分子对接进一步预测KRP-203与谷氨酰胺转运蛋白GlnQ具有高亲和力结合。值得注意的是，经过60代连续诱导后，金黄色葡萄球菌对KRP-203的MIC值升高了8倍，提示长期使用存在诱导耐药的风险。综上，KRP-203作为一种已获批临床使用的S1P受体调节剂，具备老药新用的潜力，有望成为治疗耐药性金黄色葡萄球菌及其生物被膜相关感染的新型候选药物。
图1、 KRP-203对金黄色葡萄球菌的抗菌活性。(A) KRP-203处理后SA113的生长曲线；(B) KRP-203处理后CHS101的生长曲线；(C) KRP-203与万古霉素对SA113的时间-杀菌曲线；(D) KRP-203与万古霉素对YUSA145的时间-杀菌曲线。
图2、 KRP-203对金黄色葡萄球菌生物被膜的抑制作用。(A) KRP-203在亚抑制浓度下对MSSA临床分离株生物被膜形成的影响；(B) KRP-203在亚抑制浓度下对MRSA临床分离株生物被膜形成的影响；(C) KRP-203对SA113成熟生物被膜中活菌数量的影响；(D) KRP-203对YUSA139成熟生物被膜中活菌数量的影响。
图3、 KRP-203诱导的金黄色葡萄球菌YUSA145中KRP-203 MIC值的动态变化。金黄色葡萄球菌YUSA145分离株在含有KRP-203的TSB培养基中连续传代培养，起始诱导浓度为1/2× MIC，并逐渐增加至更高浓度。WGS：全基因组测序。
图4 、 KRP-203处理后金黄色葡萄球菌SA113的定量蛋白质组学分析。(A) 差异表达蛋白的火山图；(B) 上调与下调蛋白的数量统计；(C) 差异表达蛋白的基因本体论功能富集分析；(D) KEGG通路富集分析；(E) 蛋白-蛋白互作网络分析。
图5、 KRP-203对金黄色葡萄球菌的抗菌机制研究。(A) KRP-203对金黄色葡萄球菌SA113细胞膜去极化的影响（DiBAC₄(3)荧光染色检测）；(B) KRP-203对金黄色葡萄球菌SA113细胞膜通透性的影响（碘化丙啶PI荧光染色检测）；(C) 外源性添加不同膜磷脂对KRP-203抗金黄色葡萄球菌SA113活性的影响（PC：磷脂酰胆碱；CL：心磷脂；PG：磷脂酰甘油；PE：磷脂酰乙醇胺）；(D) 生物层干涉测量法检测KRP-203与心磷脂（CL）的结合动力学；(E) 生物层干涉测量法检测KRP-203与磷脂酰甘油（PG）的结合动力学；(F) KRP-203与谷氨酰胺转运ATP结合蛋白GlnQ的分子对接模拟结果。
总结
本研究揭示了老药新用的潜力。原本用于治疗白血病的免疫调节剂Mocravimod（KRP-203），被发现能有效对抗临床分离的金黄色葡萄球菌，包括耐甲氧西林菌株（MRSA）。该药物通过破坏细菌细胞膜的完整性来发挥杀菌作用，具体表现为引起膜去极化、增加膜通透性，并能与膜上的关键脂质成分如心磷脂和磷脂酰甘油直接结合。在实验中，KRP-203展现出快速且强效的杀菌活性，在8倍最低抑菌浓度下仅需2小时即可彻底清除浮游细菌，杀灭速度优于传统抗生素万古霉素。此外，即使在亚抑制浓度下，该药也能显著抑制细菌生物被膜的形成（最高减少约70%），并有效清除已形成的成熟生物被膜中的细菌。为进一步阐明其作用机制，研究者进行了全基因组测序和定量蛋白质组学分析，发现药物处理会导致与膜功能和脂质代谢相关的基因发生突变，并显著下调一种关键的毒力因子——穿孔毒素HlgC的表达。分子对接实验还预测了KRP-203与谷氨酰胺转运蛋白GlnQ具有高亲和力结合。尽管该研究证实了KRP-203作为抗菌候选药物的巨大潜力，但其相对较高的抑菌浓度限制了全身应用的可能性，且长期使用也可能诱导细菌耐药性。未来的研究将聚焦于结构优化以提高药效，并在动物模型中验证其体内安全性与疗效。Bioscreen C全自动微生物生长曲线分析仪被用于评估KRP-203对金黄色葡萄球菌浮游生长的影响。Bioscreen全自动生长曲线分析仪具有高通量、自动化、连续监测的方式替代了人工间断取样测 OD 的低效率与操作误差，能在同一实验批次内完成多组平行重复（n=3）的长时间动态追踪，
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