摘要
纤维素生物燃料的经济性生产需要高效且充分地利用酶混合物从植物生物质中天然释放的所有丰富碳水化合物。最近，我们在酿酒酵母中重建了粗糙脉孢菌的木糖糊精转运与消耗系统，使酵母能够在好氧条件下以木糖糊精为碳源生长。然而，木糖糊精的消耗速率需要进一步提高才能满足工业应用的需求，包括在厌氧条件下的消耗。作为改进的第一步，我们报告了对粗糙脉孢菌转运体CDT-1和CDT-2直系同源物的分析。来自绿色木霉的转运体ST16使酿酒酵母在木糖糊精上的好氧生长速率相比CDT-2更快。ST16是一种木糖糊精特异性转运体，其木二糖转运活性不受纤维二糖抑制。筛选中鉴定出的其他转运体也能使酵母利用包括木三糖在内的木糖糊精。综上所述，这些结果表明多种转运体可能有助于提高酿酒酵母对木糖糊精的利用。利用定向进化改进染色体整合拷贝的ST16的尝试未获成功，原因是酵母在选择培养基中存在的其他碳源上发生了背景生长。未来的实验需要提高酵母群体在木糖糊精上的基础生长速率，以确保施加于木糖糊精转运的选择压力能够分离出改进的木糖糊精转运体。
引言
从植物生物质生产纤维素生物燃料需要高效利用植物细胞壁中所有丰富的碳水化合物。为了使发酵过程在经济上可行，工程化酵母应能够同时消耗酶混合物天然释放的混合糖类，包括己糖和戊糖。木糖糊精（XD），如木二糖和木三糖，是β-1,4-连接的木糖寡聚物。它们来源于半纤维素——木质纤维素中主要的生物质形式之一——并被β-木糖苷酶水解为木糖。2004年报道了首个从木聚糖生产乙醇的实例，其中木聚糖酶和β-木糖苷酶被展示在表达木糖消耗途径的酿酒酵母细胞表面。然而，这种重组酿酒酵母菌株的木聚糖降解和木糖利用能力需要进一步优化才能用于工业生产。最近，一个来自粗糙脉孢菌的XD利用途径被鉴定出来，该途径需要转运体CDT-2以及两种胞内β-木糖苷酶GH43-2和GH43-7，随后被工程化到酿酒酵母中，使酵母能够在好氧条件下以XD为碳源生长，或将XD与木糖或其他己糖共发酵。然而，XD的消耗速率仍然相当缓慢，因此需要改进以满足未来的工业应用需求。
转运体CDT-2属于主要协助转运体超家族（MFS），这是最大且最普遍存在的次级转运体亚家族之一。其成员存在于从细菌到哺乳动物的所有物种中，大小从400到600个氨基酸不等，由12个跨膜α-螺旋组成。CDT-2属于MFS转运体的己糖家族，该家族包括酵母己糖转运体、人葡萄糖转运体和木糖转运体。
对于工业应用而言，天然转运体通常需要进一步工程化才能达到最优。蛋白质工程，包括理性设计和定向进化方法，已被广泛用于改进多种酶和途径的性能。然而，对膜蛋白（如MFS转运体）进行工程化已被证明具有挑战性。定向进化是进行蛋白质工程的重要手段，但需要开发高通量筛选系统。2014年，Ryan等人开发了一种在酵母中使用CRISPR-Cas9系统进行定向进化实验的新方法。通过同源重组介导的CRISPR-Cas9将线性DNA整合到基因组中，克服了基于质粒表达所见的拷贝数变异问题，并使CDT-1的定向进化得以分离出改进的纤维糊精转运体。
为了提高酿酒酵母对木糖糊精的利用，我们希望通过表征CDT-1和CDT-2转运体直系同源物文库来鉴定潜在的XD转运体。我们分析了细胞定位、转运活性和好氧生长特征。此外，利用筛选中鉴定出的最佳转运体之一，我们尝试使用CRISPR-Cas9介导的定向进化来改进XD的消耗。
材料与方法
菌株与质粒
粗糙脉孢菌的cdt-1和cdt-2从在 minimal media 加 Avicel（微晶纤维素）作为唯一碳源生长的粗糙脉孢菌（FGSC 2489）分离的mRNA合成的cDNA经PCR扩增获得。所有ST转运体的密码子优化版本由Atum（原DNA 2.0）进行基因合成和密码子优化。粗糙脉孢菌和所有ST转运体被克隆到pRS316质粒（CEN URA3）中，受酿酒酵母TDH3启动子和CYC1终止子控制，使用In-Fusion HD克隆试剂盒（Clontech Laboratories, Inc., Mountain View, CA）。HRV 3C蛋白酶切割位点后接eGFP融合到C末端。密码子优化的gh1-1被克隆到pRS315质粒（CEN LEU）中，受PGK1启动子控制。gh1-1密码子优化过程的细节在先前描述。
酿酒酵母菌株D452-2用于XD和纤维二糖转运研究。酿酒酵母菌株SR8用于菌株工程化。我们使用CRISPR-Cas9基因组编辑将GH43-2和GH43-7分别插入TRP1和LYP1位点，工程化的SR8菌株命名为SR8A。GH43-2受TDH3启动子和ADH1终止子控制，而GH43-7受CCW12启动子和CYC1终止子驱动。
生长条件
酵母生长实验使用缺乏尿嘧啶或尿嘧啶加亮氨酸的优化最小培养基（oMM）。oMM含有10 g/L (NH₄)₂SO₄、1 g/L MgSO₄·7H₂O、6 g/L KH₂PO₄、100 mg/L腺嘌呤半硫酸盐、1.7 g/L YNB（Sigma-Aldrich, Y1251）、2倍推荐量的CSM-Ura dropout混合物（MP Biomedicals, Santa Ana, CA）、10 mg/L肌醇、100 mg/L谷氨酸、20 mg/L赖氨酸、375 mg/L丝氨酸、100 mM吗啉乙磺酸（MES），pH 5.7。根据实验需要向此基础配方中添加纤维二糖或木糖糊精。
对于定向进化实验，菌株在30°C下于富培养基（酵母提取物-蛋白胨[YP]）或合成（S）培养基中生长，培养基含1%木糖糊精，并添加适当的营养补充剂以支持生长，同时省略某些营养成分以维持对质粒的选择。木糖糊精购自Cascade Analytical Reagents and Biochemicals。XD样品的成分使用Dionex ICS-3000 HPLC（ThermoFisher）分析，如下所述。合成培养基含2 g/L无氨基酸和硫酸铵的酵母氮源、5 g/L硫酸铵、1 g/L...