电子显微镜
野生型和突变体在5 mL TSB中于37°C培养至稳定期，然后细胞以5000 g离心20分钟。每个菌株所得沉淀的三分之一用于接种20 mL TSB，其余部分用于接种20 mL 1/3 TSB。培养物在37°C剧烈振荡过夜培养。然后按所述方法处理样品进行薄切片电子显微镜观察。使用JEM-1230透射电子显微镜进行观察。
实时定量PCR测定基因表达
按先前描述的方法制备羊布鲁氏菌16M、ΔcbpB::km突变体和互补菌株CcbpB或CBBRcbpB的总RNA样品。所得cDNA样品用作实时定量PCR的模板。使用PRIMER 5.0软件（Applied Biosystems）设计引物，以生成100-250 bp的PCR产物，引物列于表S1（胁迫相关基因）和先前描述（pbp基因和细胞分裂基因）。不含逆转录酶的反应用作阴性对照以检测DNA污染。使用SYBR green mix（Applied Biosystems）在96孔光学反应板（Applied Biosystems）中进行实时定量PCR。使用Applied Biosystems Step One Plus实时PCR仪，对每个引物使用ΔΔCT方法计算比值。每个靶标mRNA的结果均归一化至16S rRNA转录水平。
数据分析
使用SPSS 17.0分析实验组和对照组均值之间的差异。使用非配对t检验分析巨噬细胞研究中的log CFU数据和涉及16M菌株攻击的胁迫耐受性研究中的CFU数据。涉及16M菌株攻击的脾脏清除研究中的CFU数据使用方差分析进行分析。
结果
羊布鲁氏菌中推定性环腺苷酸结合蛋白的鉴定
对羊布鲁氏菌16M基因组的BLAST分析鉴定出六个含有潜在CAP结构域序列的基因（图1a）。BMEI0067仅编码一个153个氨基酸的蛋白CbpB，由一个保守的CAP区域组成（氨基酸1-128；图1a），该基因与编码应答调节因子otpR的另一个基因之间有一个35 bp的间隔区。
图1. 羊布鲁氏菌中的推定性环腺苷酸结合蛋白。 (a) 对16M基因组的BLAST分析鉴定出六个编码预测结合环腺苷酸的蛋白的基因。HTH结构域（辅因子调节结构域）和CAP结构域（环核苷酸或小分子结合）。(b) 编码推定性环腺苷酸结合蛋白BMEI0067（CbpB）的位点和ΔcbpB::km突变体。
CbpB在C端区域含有一个环腺苷酸结合结构域，并与细菌推定性环腺苷酸结合结构域具有同源性：它表现出与大肠杆菌推定转录调节因子（Crp）（27%同一性）和铜绿假单胞菌环腺苷酸结合蛋白CbpA（26%同一性）的序列相似性。布鲁氏菌CbpB的环腺苷酸结合结构域也与小鼠和人蛋白激酶A调节亚基蛋白（PRKAR1B；24%同一性）具有同源性。布鲁氏菌BMEI0067的氨基酸序列在布鲁氏菌属中是保守的，如猪布鲁氏菌BR_2005和流产布鲁氏菌BAB1_2005（99-100%氨基酸同一性）。组成环腺苷酸直接结合位点的氨基酸残基也是高度保守的。
ΔcbpB::km突变体及其互补菌株的构建
为评估CbpB的功能，我们构建了标记的cbpB缺失突变体ΔcbpB::km（图1b）。cbpB缺失突变体通过将卡那霉素抗性盒插入基因位置获得（图1b）。本研究使用的菌株和质粒描述于表S1。实时定量PCR显示ΔcbpB::km突变体中otpR的转录与野生型相似（数据未显示），表明cbpB突变体中otpR的转录未受影响。otpR和cbpB共享一个共同启动子。因此，为获得ΔcbpB::km突变体的互补菌株，将cbpB的启动子序列和编码序列连接在一起，然后插入pMR10A和pBBR1MCS。然后构建重组载体pMRcbpB或pBBRcbpB并电转化至ΔcbpB::km突变体中，该互补菌株分别称为CcbpB和CBBRcbpB。
接下来，我们检测了这些菌株在液体培养基中的表型。16M和ΔcbpB::km突变体与抗羊布鲁氏菌光滑LPS的IgG发生协同凝集，吖啶黄凝集阴性，菌落不吸收结晶紫，表明突变体呈现光滑表型。
突变体在BALB/c小鼠和专业吞噬细胞中的复制
图2a中的结果似乎表明感染后1小时摄取没有显著差异，表明该缺陷对摄取没有影响。在感染后长达72小时内，cbpB对于RAW264.7巨噬细胞的有效感染并非必需（图2a）。突变体菌株在接种后1周和4周回收的数量与野生型相似，但在8周和12周时回收的突变体细菌显著少于野生型细菌（图2b）。这些结果表明CbpB参与小鼠持续性感染。
图2. CbpB对RAW264.7巨噬细胞和BALB/c小鼠感染的贡献。 (a) 羊布鲁氏菌16M、ΔcbpB::km和CBBRcbpB在RAW264.7小鼠巨噬细胞中72小时内的增殖。数值代表三次重复实验之一的平均值，误差线表示标准差。检测限为10 CFU。(b) 羊布鲁氏菌16M和ΔcbpB::km以及CBBRcbpB在BALB/c小鼠中的脾脏定植。每个数据点代表五只接种小鼠的平均值。，P<0.05；，P=0.001（相对于16M）。
cbpB失活导致布鲁氏菌在胁迫期间活力丧失
ΔcbpB::km突变体在TSB培养基中的生长比例与野生型相似（图3a）。在42°C时，与野生型菌株相比，ΔcbpB::km的生长比例在24小时降低约8.9倍，在48小时降低约9.0倍（图3b）。此外，ΔcbpB::km菌株在1/3 TSB培养基中培养时表现出显著的生长缺陷（图3c）。
图3. cbpB突变导致胁迫耐受性改变。 (a) 野生型和ΔcbpB::km在TSB培养基中的生长曲线。培养物从初始OD₆₀₀为0.01接种于Bioscreen微生物生长曲线仪的蜂窝板中。细菌在TSB培养基中连续振荡培养72小时。每4小时测量一次光密度。图表代表两次代表性实验之一中每个条件的技术重复的平均OD。(b-d) 突变体菌株和野生型菌株在37°C TSB中(b)、42°C TSB中(c)和37°C 1/3 TSB中(d)的生长比例（CFU）。数值代表三次重复实验之一的平均值，误差线表示标准差。P<0.05（t检验）。
cbpB突变体对多粘菌素B的敏感性与野生型或互补菌株一样具有抗性（图4a）。
暴露于各种浓度H₂O₂ 1小时后，ΔcbpB::km菌株的存活率与相同条件下的野生型相比没有显著差异（图4b）。在SDS存活试验中，cbpB突变体与野生型菌株相比表现出降低的存活比例（图4c）。突变体对这种外源洗涤剂的敏感性可通过质粒pMRcbpB进行反式互补（图4c）。
图4. cbpB突变体对SDS的敏感性。 (a) 16M和CbpA突变体对多粘菌素B的敏感性。(b) ΔcbpB::km突变体在各种浓度H₂O₂下的存活。数据为CFU mL⁻¹的平均值。(c) 16M、ΔcbpB::km突变体和CcbpB在100 μg mL⁻¹ SDS中的细菌存活。数值代表三次重复实验之一的平均值，误差线表示标准差。P<0.01（非配对t检验）。
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