2.2副干酪乳杆菌Lab5菌液与热灭活菌液的抗菌活性
为确定不同组分发酵菌液的抑菌活性，制备灭活发酵上清液、灭活菌悬液、细胞裂解物进行抑菌实验，结果如图2、表3所示，发现只有灭活CFS对指示菌有抑菌效果，说明具有抑菌效果的物质存在于发酵上清液中。Behrooz等也发现副干酪乳杆菌B31-2的发酵上清液对单增李斯特菌表现出显著抗菌活性，这与本文结果一致，但并未进一步阐明其他组分是否具有抑菌效果。
图 2 副干酪乳杆菌Lab5发酵上清液对不同指示菌的抑菌活性
注：A为指示菌ListeriamonocytogenesATCC19115；B为指示菌EscherichiacoliATCC25922。
表 3 副干酪乳杆菌Lab5发酵菌液不同组分对指示菌生长性能的影响
| 指标 | 10~8分 | 6~8分 | 4~6分 | 2~4分 | 0~2分 |
|---|---|---|---|---|---|
| 色泽 | 鲜亮有光泽 | 较鲜亮有光泽 | 暗红无光泽 | 暗灰无光泽 | 暗褐无光泽 |
| 气味 | 鲜味强无异味 | 鲜味较强无异味 | 鲜味淡略有异味 | 无鲜味儿异味较大 | 无鲜味，重异味且不能接受 |
| 弹性 | 弹性很好，指压后立即恢复 | 弹性较好，指压后可以恢复 | 弹性较差，指压后缓慢恢复 | 弹性基本丧失，指压后不能恢复 | 无弹性，指压后凹陷明显不恢复 |
| 粘度 | 外部微湿不黏手 | 外部湿润不黏手 | 外部干燥微黏手 | 外部干燥较黏手 | 外表有粘液很黏手 |
| 大理石纹理 | 纹理清晰，花纹丰富 | 纹理清晰，花纹丰富 | 纹理不清晰，花纹微丰富 | 纹理模糊，有少量花纹 | 无纹理 |
注：“−”表示抑菌圈≤8mm，即无抑菌圈、无抑菌活性。
2.3副干酪乳杆菌Lab5发酵上清液抑菌活性的热稳定性
热稳定性实验结果如图3，发现随温度的升高，发酵液抑菌活性降低。但经60、70、80、90、100、121℃处理后，副干酪乳杆菌Lab5CFS对单增李斯特菌仍保持较高抑菌活性且无显著性差异（P>0.05）。经100、121℃处理后发酵上清液与对照组相比，对大肠杆菌的抑菌活性有差异但不显著（P>0.05）。121℃处理25min后，副干酪乳杆菌Lab5CFS对单增李斯特菌和大肠杆菌抑菌圈仍分别达到32.07±2.1mm、11.53±0.44mm，以上结果表明副干酪乳杆菌Lab5CFS热稳定性好。
图 3 温度对副干酪乳杆菌Lab5发酵上清液抑菌活性的影响
注：图中不同小写字母代表不同温度处理组对指示菌（ListeriamonocytogenesATCC19115或EscherichiacoliATCC25922）抑菌圈直径的差异显著（P<0.05），图4~图5同。
Huang等发现乳酸菌发酵液粗提物的抗菌活性在40~100℃间具有较高的稳定性，而在121℃下抑菌面积减少约26.15%。副干酪乳杆菌Lab5CFS经121℃处理后对单增李斯特菌的抑菌面积减少10.87%。良好的热稳定性对其应用于食品加工是非常有利的。
2.4副干酪乳杆菌Lab5发酵上清液抑菌活性的蛋白酶敏感性
选取6种代表性蛋白酶进行抑菌实验，探究其蛋白酶敏感性（图4），与对照组相比，热灭活副干酪乳杆菌Lab5CFS经蛋白酶处理后抑菌活性均下降，蛋白酶K组对单增李斯特菌和大肠杆菌的抑菌活性影响最大（P<0.05），抑菌圈直径分别为26.33±0.74mm、8.84±0.56mm，比对照组减小了7.69mm、3.18mm；胃蛋白酶组对单增李斯特菌和大肠杆菌抑菌圈直径分别减小5.39mm、2.87mm。经蛋白酶处理后抑菌活性下降，热灭活副干酪乳杆菌Lab5CFS中可能含有蛋白质或肽类抑菌物质。不同于许多乳酸菌株CFS对蛋白酶表现出高敏感性特征，经蛋白酶K、胃蛋白酶、胰蛋白酶和木瓜蛋白酶处理后完全丧失活性。副干酪乳杆菌Lab5CFS经蛋白酶处理后虽抑菌活性下降但仍有较好抑菌效果，结果表明其对六种蛋白酶较不敏感，在食品工业中具有很好的应用潜力。
图 4 蛋白酶处理对热灭活副干酪乳杆菌Lab5发酵上清液的抑菌活性的影响
2.5副干酪乳杆菌Lab5发酵上清液抑菌活性的pH稳定性
如图5所示，将灭活副干酪乳杆菌发酵液的pH调整至不同pH处理1h，在pH3.0~8.0时抑菌活性未发生显著变化（P>0.05），在接近初始pH3.51的pH4时抑菌活性降低最少，当pH9.0时，副干酪乳杆菌Lab5灭活发酵上清液抑菌活性显著降低（P<0.05）。在强碱性条件下，副干酪乳杆菌LabCFS抑菌活性降低可能是由于其中含有乳酸、乙酸等有机酸，有机酸因解离而失去抑菌活性。乳酸菌代谢产物具有广谱抑菌性，其抑菌活性具有酸依赖性，例如乳酸链球菌代谢产物，而副干酪乳杆菌Lab5灭活发酵上清液在pH3.0~8.0范围内pH稳定性好，为其在猪肉等食品保鲜中应用提供了可能性。
图 5 pH对热灭活副干酪乳杆菌Lab5发酵上清液的抑菌活性的影响
2.6副干酪乳杆菌Lab5生长曲线及其灭活CFS抑制单增李斯特菌的最小抑菌浓度
生长曲线如图6，OD600nm值显示培养6~18h即进入对数生长期，20h左右进入稳定期。pH在培养6h后开始发生变化，6~24hpH迅速下降，从5.33降至3.86，24~41hpH缓慢下降，41h后恒定在3.5左右。抑菌实验结果显示副干酪乳杆菌生长开始产生抑菌物质，培养44h时抑菌活性达到最高，随后保持稳定。整个过程与pH的变化无关，结果表明副干酪乳杆菌Lab5在整个生长期间一直产生抑菌物质。
图 6 副干酪乳杆菌Lab5的生长曲线及抑菌活性
微量肉汤稀释法结果显示灭活副干酪乳杆菌Lab5CFS低于12.5mg/mL时单增李斯特菌可以生长，而12.5mg/mL浓度处理下的OD600nm值与阴性对照组无显著差异，表明ListeriamonocytogenesATCC19115生长完全受到抑制，因此确定其对单增李斯特菌的MIC为12.5mg/mL。
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