2.3 菌株筛选
2.3.1 一级筛选：胆盐解离能力
参考姜金池的方法加以改进，将浓度为0.3%的脱氧牛磺胆酸钠、0.2%的巯基乙酸钠、0.37 g/L的氯化钙和1.5%的琼脂加入到MRS液体培养基中，高温灭菌后倒入平板中，凝固后将无菌圆形滤纸片置于培养基表面，再取经过调节后600 nm处吸光度值相同的菌液10 μL滴在纸片上，37℃培养72 h，观察滤纸片周围是否有白色沉淀圈，若有沉淀圈则证明该菌株具有胆盐解离能力。
2.3.2 二级筛选：体外降胆固醇能力
高胆固醇液体培养基（胆固醇含量为0.2 mg/mL）的配制：使用无水乙醇与胆固醇制备10 mg/mL的胆固醇溶液6 mL，再加入0.6 g牛胆盐、0.3 g蔗糖脂肪酸酯和6 mL吐温-80，混匀后加入288 mL MRS肉汤中，121℃高压蒸汽灭菌15 min，灭菌后摇匀。
参考孙晓琛等的方法绘制标准曲线，按5%（V/V）接种量将活化好的菌株接种于高胆固醇液体培养基中，37℃分别培养0、4、8、12、16、24 h，取1 mL培养液，9391×g离心10 min后取上清液，采用邻苯二甲醛（P816032-5g，上海麦克林生化科技股份有限公司）法测定上清液中胆固醇含量，并按照以下公式计算胆固醇去除率：
胆固醇去除率（%）= [ (A0 - A1) / A0 ] × 100
式中：A0为0 h时上清液中胆固醇含量（mg/mL）；A1为培养4、8、12、16、24 h后上清液中胆固醇含量（mg/mL）。
2.4 生长及益生特性测定
2.4.1 生理生化特性鉴定
选取具有胆盐解离能力、体外降胆固醇能力最优的植物乳杆菌，取活化好的菌液使用HBI乳酸菌生化鉴定条（HBIG11，青岛海博生物科技有限公司）进行生理生化特性鉴定。
2.4.2 生长性能和产酸性能测定
取活化好的菌液以5%（V/V）的接种量接种于MRS培养基中，37℃恒温培养。分别于0、2、4、6、9、12、15、18、24、30、36 h取样测定培养液600 nm处吸光度值和pH。以时间为横坐标，以培养液的600 nm处吸光度值和pH为纵坐标，分别绘制其产酸曲线和生长曲线。
2.4.3 自由基清除率测定
使用超氧阴离子、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH）和2,2-联氮-二（3-乙基-苯并噻唑-6-磺酸）二铵盐（ABTS）自由基检测试剂盒（苏州格锐思生物科技有限公司）进行测定，按照说明书操作。
2.4.4 耐高温能力测定
取活化好的菌液分别置于50和60℃的温度中水浴处理3 min，冷却后取100 μL菌液梯度稀释后平板涂布计算活菌数，试验重复3次，并按照以下公式计算存活率：
存活率（%）= (A3 / A2) × 100
式中：A2为处理前存活细菌的数量（CFU/mL）；A3为处理后存活细菌的数量（CFU/mL）。
2.4.5 胃肠道定植能力测定
2.4.5.1 耐酸能力测定
取活化好的菌液于4℃、9391×g离心5 min，使用无菌磷酸盐缓冲溶液（PBS，pH=7.0）洗涤3次，然后分别在pH为2、3、4的MRS液体培养基中重新悬浮。37℃培养0和3 h后取100 μL菌液梯度稀释后平板涂布，37℃培养24 h，通过活菌落计数来评估分离菌株对酸的耐受性，试验重复3次。存活率计算公式同2.4.4。
2.4.5.2 耐胆盐能力和人工胃肠液耐受性测定
参考张媛媛等的方法进行测定。取活化好的菌液于4℃、9391×g离心10 min，弃去上清液后用无菌PBS洗涤3次，重新悬浮在受试培养基中。于37℃孵育后，采用10倍梯度稀释法将稀释的培养物涂布于MRS琼脂平板上，37℃孵育24 h，通过活菌落计数来评估菌株对胆盐和人工胃肠液的耐受性，试验重复3次。存活率计算公式同2.4.4。
2.4.5.3 表面疏水性测定
取活化好的菌液于4℃、9391×g离心10 min，用无菌PBS洗涤3次后，调节菌液630 nm处吸光度值为0.25±0.05，备用。以1:1的比例将调整好的菌液分别加入到二甲苯、氯仿和二甲苯:氯仿=1:1的混合液中，涡旋振荡3 min，37℃孵育4 h。吸取水相测量630 nm处吸光度值计算疏水率，试验重复3次。疏水率计算公式如下：
疏水率（%）= (1 - A5 / A4) × 100
式中：A4为孵育之前菌液的630 nm处吸光度值；A5为孵育之后菌液的630 nm处吸光度值。
2.4.5.4 自凝聚力测定
取活化好的菌液于4℃、9391×g离心10 min，用无菌PBS（pH=7.0）洗涤3次后重悬，测量630 nm处吸光度值，然后涡旋振荡10 s，置于37℃孵育8、16和24 h，小心吸取上部测量630 nm处吸光度值，计算自凝聚率，试验重复3次。自凝聚率计算公式如下：
自凝聚率（%）= (1 - A7 / A6) × 100
式中：A6为孵育之前菌液的630 nm处吸光度值；A7为孵育之后菌液的630 nm处吸光度值。
2.4.5.5 抑菌活性测定
菌株的抑菌活性参考张媛媛等的方法采用牛津杯琼脂扩散法进行测定。供试菌株为大肠杆菌（ATCC25922）、沙门氏菌（ATCC14028）、金黄色葡萄球菌（ATCC25923）、铜绿假单胞菌（ATCC27853）和单核细胞增生李斯特菌（ATCC19115）。
2.4.5.6 抗生素敏感性测定
菌株的抗生素敏感性参考张媛媛等的方法采用纸片扩散法进行测定。选择30种抗生素，以直径6 mm的纸片作为抗生素载体进行测试。取活化好的菌液于4℃、9391×g离心10 min，用无菌PBS洗涤3次后重悬，取100 μL菌悬液涂布于MRS琼脂平板上后将抗生素纸片贴于平板表面，于37℃恒温培养24 h，观察是否有抑菌圈，并用游标卡尺测量抑菌圈直径。试验重复3次。
2.5 安全性评价
2.5.1 溶血试验
取活化好的菌液在胰酪胨大豆羊血琼脂（TSSB）（HBPM0251，青岛海博生物科技有限公司）上划线，37℃培养48 h，观察血琼脂平板是否存在溶血迹象。使用金黄色葡萄球菌（ATCC25923）作为阳性对照。
2.5.2 小鼠安全性试验
为了进行体内安全性评价，将健康、体重接近的昆明系小白鼠48只随机分为4组，每组12只，每组公母各1/2。对照组（CON组）小鼠每日灌服0.2 mL无菌生理盐水，其他3组的小鼠分别每日灌服0.2 mL 1×109（L组）、1×1010（M组）和1×1011（H组）CFU/mL的菌液。每3 d记录1次采食量，每7 d称量1次体重，计算平均日增重（ADG）和平均日采食量（ADFI），并记录小鼠的健康状况。持续28 d后，将小鼠禁食12 h后用1%戊巴比妥钠（50 mg/kg）麻醉。于眼眶静脉丛采血，将血液于4℃、2015×g离心10 min收集血清，测定血清生化指标。将小鼠脱颈处死后，解剖观察其内脏情况，将肝脏、肾脏等器官称重并计算器官指数，计算公式如下：
器官指数（%）=（器官重量 / 体重）× 100
2.6 统计分析
使用MEGA11进行进化树构建，使用Excel 2021进行数据记录，使用Graphpad Prism 10.1.2创建结果图，使用SPSS 26.0软件进行单因素方差分析（one-way ANOVA）并通过Duncan氏法进行组间多重比较，试验结果以“平均值±标准差”表示，P<0.05为差异显著，P>0.05为差异不显著。
相关新闻推荐
1、Bioscreen C实时监测变形链球菌生物膜形成氧依赖性调控机制（二）
2、肠道微生物及其代谢产物可调节血脑屏障结构和功能完整性（一）