摘要:旨在建立猪乳腺上皮细胞(PMEC)的原代培养方法，为猪乳腺发育、分化及泌乳机制研究和病原体感染提供生物材料和细胞模型。以9月龄未孕健康母猪的乳腺组织为研究对象，利用胶原酶Ⅰ型和透明质酸酶联合消化法分离PMEC，通过形态学观察、生长曲线测定、间接免疫荧光试验(IFA)、聚合酶链式反应(PCR)、免疫印迹试验(Western blot)对其进行鉴定。结果:经酶消化组织块法获得的PMEC呈现鹅卵石状、上皮样形态并形成单层聚集形岛屿，冻存复苏后细胞生长状态良好，且纯化后的PMEC具备正常的“S”型生长周期;经浓度为0.2 mg/L与2 mg/L的催乳素刺激PMEC后，采用PCR、Western blot方法检测发现细胞中β-酪蛋白(CNS2)的表达水平显著升高(P<0.05)，且升高趋势与催乳素的浓度呈正相关;IFA结果显示分离的PMEC表达特异性标记物细胞角蛋白18(CK-18)，且表达紧密连接蛋白(ZO-1)，表明该细胞形成良好的紧密连接。本研究成功建立了PMEC的分离、培养及鉴定体系，为进一步研究乳腺生物学及相关机制奠定了基础。
乳腺作为哺乳动物体内独有的腺体组织，承载着新生动物获取宝贵初乳的重任。乳腺上皮细胞(MEC)可合成并分泌乳蛋白、乳糖和脂类，是机体黏膜免疫系统的一部分，是抵御病原体的第一道屏障。MEC具有分泌特异性β-酪蛋白(CNS2)的特性，这一特性进一步强调了其在乳汁合成过程中的核心地位。在妊娠与哺乳这一生命循环的关键阶段，MEC在催乳素的精密调控下，经历了从增殖到分化的精妙转变。这种激素不仅是启动产乳过程的“钥匙”，更是维持整个哺乳期间乳汁持续分泌的“引擎”。通过调节MEC的活性与功能，催乳素确保了哺乳动物能够顺利地进行哺乳，为后代的健康成长提供坚实的营养保障。
已报道多种病毒可经乳汁进行垂直传播，如寨卡病毒(ZIKV)、人类免疫缺陷病毒(HIV)、巨细胞病毒(CMV)、猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)等。尽管有研究者试图对病毒经乳汁垂直传播的机制进行研究，但由于难以在围生期母体体内获取组织样本以及合适的实验动物模型的缺乏限制了对其他研究。因此，当前亟需开发并建立一种可靠的细胞模型，以模拟并解析病毒经乳汁垂直传播的复杂过程，这对于理解病毒传播机制、评估公共卫生风险以及制定有效的防控策略具有至关重要的意义。
在本研究中，首先通过酶消化组织块法分离出猪乳腺上皮细胞(PMEC)，其次通过连续传代对细胞进行纯化，并进行生长曲线的测定。最后通过间接免疫荧光试验(IFA)、聚合酶链式反应(PCR)和免疫印迹试验(Western blot)从分子水平和蛋白水平对PMEC进行鉴定，结果表明本研究成功分离出PMEC，对阐明营养物质和激素刺激猪乳腺合成乳汁的潜在机制具有重要的生物意义，同时为病原体经乳汁传播的机制研究提供工具。
1材料与方法
1.1试验动物及组织采集
选择健康的9月龄未怀孕、未妊娠长白母猪(来源于保定某猪场)，将其麻醉后，使用75%酒精将母猪发育良好的乳房及其周围进行消毒，使用高压灭菌的手术器械割开表皮组织，沿筋膜表面分离乳腺组织，切除乳腺，半径为2~3 cm，深度约为皮下3 cm，将切割下来的组织放入含75%酒精的烧杯中，3~5 min后，将组织放入含2%双抗的PBS溶液中浸泡5 min左右，便于分离PMEC。
1.2主要试剂
DMEM/F12培养基、0.25%胰蛋白酶、青-链霉素(双抗)、胎牛血清(FBS)，购自Gibco公司(美国);氢化可的松、无动物成分重组人表皮生长因子(EGF)蛋白、细胞角蛋白18(CK-18)多克隆抗体，购自Bioss公司(北京);ECL化学发光超敏显色试剂盒、牛胰岛素，购自翌圣生物科技(上海)股份有限公司;庆大霉素、胶原蛋白酶A、透明质酸酶，购自泰克兰博公司(北京);催乳素购自Med Chem Express生物科技公司(美国);细胞裂解液、100%甲醇、抗CNS2单克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗鼠免疫球蛋白G(IgG)、HRP标记的山羊抗兔IgG，购自索莱宝科技有限公司(北京);兔抗β-肌动蛋白(β-actin)多克隆抗体购自Servicebio公司(武汉);Protein Marker购自上海雅酶生物医药科技有限公司;细胞计数试剂盒(CCK-8检测试剂盒)购自APExBIO公司(美国);紧密连接蛋白(ZO-1)抗体购自Invitrogen公司(美国);YF488山羊抗鼠IgG、YF594山羊抗兔IgG，购自苏州优逸兰迪生物科技有限公司。
1.3试验方法
1.3.1猪乳腺的采集与PMEC的分离
为从9月龄非怀孕、非妊娠期母猪的乳腺中分离PMEC，采用高压灭菌后的手术器械将母猪发育良好的乳腺(上层皮肤、中间组织及下层肌肉)取下，放入含75%医用酒精的烧杯中消毒5 min左右，再将其转入含2%双抗的PBS中洗涤10遍左右，用高压消毒的手术器械将乳腺的上层皮肤及下层肌肉剥离，并将其剪切为约1 mm3的组织块，移入含30 mL添加有5%FBS、2%双抗溶液、50 mg/L庆大霉素、500 mg/L胶原酶A及0.05%透明质酸酶DMEM消化培养基的50 mL离心管中，置于37℃、5%CO2的培养箱中消化12 h。消化完毕后，将悬液经70 nm过滤器过滤到50 mL离心管中，离心2 000 r/min，8 min。弃去上清液，再用含2%双抗溶液的DMEM培养液重悬沉淀，共洗涤2次，离心2 000 r/min，8 min。最后用1 mL含5 mg/L牛胰岛素、5 mg/L氢化可的松、10 ng/mL EGF、50 mg/L庆大霉素、10%FBS和2%双抗的DMEM培养液重悬沉淀，将其转移到T25细胞培养瓶中，补充营养液至6 mL。根据细胞生长情况适当换液。
1.3.2 PMEC的传代和冻存
弃去细胞瓶中的营养液，用PBS洗涤2次，洗去残留营养液，加入胰酶-EDTA消化，边消化边拍打，待细胞脱壁后，加入含胎牛血清的营养液终止消化，然后根据细胞生长情况对细胞进行1∶3传代。将生长情况良好的细胞保存在冻存液中，放入液氮罐长期保存。
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