摘要
羊布鲁氏菌拥有一个包含两个组分的操纵子：应答调节因子OtpR和一个由BMEI0067基因编码的推定性环腺苷酸依赖性蛋白激酶调节亚基。在先前的研究中，OtpR的功能已被研究，但对BMEI0067基因的功能知之甚少。利用生物信息学方法，我们发现BMEI0067基因编码一个额外的推定性环腺苷酸结合蛋白，我们将其命名为CbpB。结构模型预测CbpB具有一个环腺苷酸结合蛋白（CAP）结构域，在结构上与真核蛋白激酶A调节亚基相似。在此，我们报道了羊布鲁氏菌中环腺苷酸结合蛋白CbpB的鉴定，该蛋白被证明参与小鼠持续性感染。ΔcbpB::km突变体表现出细胞伸长、细胞表面气泡状突起，以及其对环境胁迫（温度、渗透压和洗涤剂）的抗性降低。有趣的是，通过比较实时定量PCR分析，cbpB突变导致羊布鲁氏菌中aqpX以及几种青霉素结合蛋白和细胞分裂蛋白的表达发生显著变化。综合这些结果，我们证明了羊布鲁氏菌中CbpB的鉴定及其在胞内存活中的关键作用。
引言
羊布鲁氏菌是家畜布鲁氏菌病和人类马尔他热的致病菌。布鲁氏菌的致病性归因于其适应细胞内复制生态位中遇到的各种环境条件的能力，包括低氧水平、酸性pH和活性氧中间体。
环腺苷酸（cAMP）是一种保守的第二信使分子，在从微生物病原体到真核细胞的许多生物体的信号转导中发挥关键作用。先前的研究表明，宿主细胞的cAMP水平参与布鲁氏菌的胞内存活。
细菌环腺苷酸受体蛋白（CRP）包含一个N端环腺苷酸结合蛋白（CAP）结构域和一个C端螺旋-转角-螺旋（HTH）DNA结合结构域。环腺苷酸与CAP结构域的结合通常会诱导构象变化，使其能够结合靶基因启动子处的特定DNA序列。然而，一些CAP蛋白没有DNA结合结构域，仅有一个环腺苷酸结合结构域。在细菌中，CAP蛋白在环腺苷酸信号传导中发挥核心作用。细菌中已描述了多种CAP蛋白：黄色粘球菌的CbpB包含两个环腺苷酸结合结构域，参与温度和渗透压胁迫抗性。在铜绿假单胞菌PAO1中，CbpA定位于有鞭毛的 old cell pole，由一个C端CAP结构域和一个N端退化CAP结构域组成，并受到Vfr的严格调控。百脉根中慢生根瘤菌的Mlok1包含六个跨膜结构域（S1-S6）、一个用于K+选择性的"GYG"特征序列和一个保守的核苷酸结合蛋白结构域，是一种原核环核苷酸敏感性K+通道，受环核苷酸调控，其核苷酸结合结构域重排以调节钾通道。这些观察结果表明CAP蛋白参与细菌中的多种过程。
包含otpR和BMEI0067的操纵子已被预测存在于多种细菌物种中，如羊布鲁氏菌、结核分枝杆菌、根癌农杆菌、百脉根中慢生根瘤菌、苜蓿中华根瘤菌和问号钩端螺旋体血清型赖型。我们先前实验室的研究已证明otpR基因参与羊布鲁氏菌16M的细菌生长、细胞形态和对β-内酰胺类药物的耐受性。BMEI0067的氨基酸序列在布鲁氏菌属中是保守的，如BR_2005和BAB1_2005（99-100%氨基酸同一性）。BAB1_2005基因编码的蛋白的转位需要流产布鲁氏菌的IV型分泌系统，表明其向宿主细胞的递送由VirB系统介导。在此，我们构建了BMEI0067基因的突变体及其互补菌株，以研究BMEI0067基因在羊布鲁氏菌中的作用。利用生物信息学方法，我们发现BMEI0067基因编码羊布鲁氏菌16M中一个额外的推定性环腺苷酸结合蛋白，我们将其命名为CbpB。结构模型表明CbpB仅有一个C端功能性CAP结构域。我们证明CbpB参与小鼠感染和对胁迫（即渗透压胁迫、高温和洗涤剂）的抗性。电子显微镜显示ΔcbpB::km在低渗透压胁迫后细胞尺寸增大，并出现布鲁氏菌外膜的囊泡。此外，羊布鲁氏菌CbpB影响布鲁氏菌水通道蛋白和几种青霉素结合蛋白及细胞分裂蛋白的表达，表明CbpB似乎是布鲁氏菌的一个重要因子。
材料与方法
细菌菌株、培养基和培养条件
大肠杆菌培养物在Luria-Bertani（Oxoid）平板上于37°C过夜培养。布鲁氏菌菌株在胰蛋白胨大豆琼脂（TSA，Bacto）或胰蛋白胨大豆肉汤（TSB）中于37°C摇床培养。需要时，抗生素按以下浓度添加：氨苄青霉素100 mg L⁻¹；卡那霉素100 mg L⁻¹。所有细菌菌株在补充25%（体积比）甘油的培养基中于-80°C冷冻保存（表1）。所有活羊布鲁氏菌操作均在生物安全三级设施中进行。
| 菌株或质粒 | 相关特性 | 来源或参考文献 |
|---|---|---|
| B. melitensis 菌株 | ||
| 16M | 野生型 | 毒力实验室 |
| ΔcbpB::km | 16M Kmr，BMEI0067 的标记突变体 | 本研究 |
| CcbpB | B. melitensis ΔcbpB::km 携带质粒 pMRcbpB | 本研究 |
| CBBRcbpB | B. melitensis ΔcbpB::Km 携带质粒 pBBRcbpB | 本研究 |
| E. coli 菌株 | ||
| DH10B | F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ 80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 endA1 araΔ139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL (Strr) nupG | Invitrogen |
| XL1-Blue | Tetr, recA1, endA1 gyrA96 thi-1 hsdR17 supE44 relA lac[F+ proAB lacIq ZΔM15 Tn10(Tetr)] | Stratagene |
| 质粒 | ||
| pBluescript II KS(+) | 克隆载体，ColE1 复制起点，Ampr | Stratagene |
| pK4 | FLP/FRT，Kmr | B. Warner |
| pBBR1MCS | 广宿主范围质粒，Cmr | |
| pBluescript-4.1 | WU733F/WU736R 克隆至 pBluescript II KS(+) | 本研究 |
| pBluescript-4.2 | pBluescript-4.1 产物经 WU177F-WU178R 切分（Kanr） | 本研究 |
| pMR10 | RK2 衍生物，低拷贝数质粒，Kanr | R. Wright |
| pMR10A | PCR pBluescript II KS(+) 产物（Ampr 盒）WU831F-WU832R 克隆至 pMR10 | 本研究 |
| pMRcbpB | ΔotpR WU281F-WU282R PCR 产物克隆至 pMR10A，用于互补实验 | 本研究 |
| pBBRcbpB | ΔotpR WU281F-WU282R PCR 产物克隆至 pBBR1MC，用于互补实验 | 本研究 |
ΔcbpB::km突变体及其互补菌株的构建
为删除cbpB（BMEI0067），设计引物以扩增基因侧翼序列（支持信息，表S1）。5'片段和3'片段分别扩增，凝胶纯化后用作第二轮重叠PCR的模板，其中使用5'片段的正向引物和3'片段的反向引物，以构建代表5'和3'片段连接产物。通过引物接头位点的限制性酶切去除连接产物的末端。最终片段经凝胶纯化后连接至pBluescript II KS(+)（Stratagene）。从pKD4质粒PCR扩增卡那霉素抗性盒并插入5'和3'片段之间。用于扩增的引物包含位于连接至pBluescript II KS(+)的片段重叠区域内的相容性限制位点。通过等位基因交换在羊布鲁氏菌中创建标记缺失突变体ΔcbpB::km，将pBluescript-4.2质粒电转化至16M菌株。通过PCR分析验证突变体基因型，确保目标基因被敲除。含有来自DotpR的WU281F-WU282R片段的pMR-cbpB或pBBR-cbpB质粒用于构建ΔcbpB::km突变体的互补菌株。为构建突变体互补菌株，将重组质粒pMR-cbpB或pBBR-cbpB转移至ΔcbpB::km中，获得互补菌株。
突变体的光滑或粗糙表型通过与感染兔获得的抗羊布鲁氏菌血清的协同凝集试验、吖啶黄凝集试验和结晶紫染色来确定。羊布鲁氏菌16M（光滑型）和RB51（粗糙型）用作对照。
布鲁氏菌突变体在巨噬细胞和BALB/c小鼠中的持续性
通过腹腔接种10⁵ CFU/只的羊布鲁氏菌16M或ΔcbpB::km至4-6周龄雌性BALB/c小鼠，评估布鲁氏菌突变体的存活或持续性。在接种后2、4、8和12周各处死4只小鼠，测定每脾脏的布鲁氏菌CFU。我们的动物实验研究经中国北京实验动物管理办公室伦理委员会批准。
为研究病原体的胞内存活，我们评估了16M及其衍生突变体在RAW264.7小鼠巨噬细胞中的增殖。该试验按所述方法进行。
胁迫试验
胁迫反应试验按所述方法进行。氧化抗性试验根据先前描述的方案并稍作修改进行。细胞（初始密度为1×10⁶ CFU mL⁻¹）在TSB中于37°C（对照）、42°C培养，然后TSB补充1/3 TSB [TSB用无菌水按1:3（体积比）稀释]用于低渗条件。在0、24、48和72小时振荡培养后测定CFU。菌株培养至1×10⁵ CFU，然后分别暴露于100 μg mL⁻¹十二烷基硫酸钠（SDS；Sigma）2小时。在化学添加前和暴露2小时后立即测定CFU mL⁻¹值。对于所有胁迫暴露，突变体菌株、16M菌株和互补菌株平行分析。
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