2 结果与分析
2.1 动物双歧杆菌NX-6的菌株生长特性
由图1A可知，在37 ℃厌氧培养的条件下动物双歧杆菌NX-6的对数生长期为2～8 h，之后进入稳定期。如图1B、C所示，NX-6菌体呈弯曲状，菌体长度为1～2 μm。为评估其肠道环境耐受能力，利用人工胃肠液处理稳定期的动物双歧杆菌NX-6和动物双歧杆菌BB12 3 h，测定其存活率。如图1D、E所示，NX-6经人工胃液和肠液处理3 h后存活率分别为65.67%和56.47%，高度显著高于商业化模式菌株动物双歧杆菌BB12的存活率（44.87%和41.50%）（P＜0.001），表明动物双歧杆菌NX-6具有良好的肠道环境耐受能力。
图1 动物双歧杆菌NX-6的菌株生长特性
2.2 动物双歧杆菌NX-6的全基因组测序分析
为了全面分析动物双歧杆菌NX-6的菌株特性，对其进行全基因组学测序分析，并结合生物信息学进行基因注释与功能预测。由图2A、表1可知，动物双歧杆菌NX-6的全基因总长为1 944 136 bp，GC碱基占比为60.49%，含有1 567 个编码基因，占总基因数目的95.49%；非编码RNA共74 个，包括12 个rRNA和52 个tRNA。利用KEGG数据库对NX-6的基因功能通路进行注释和统计，结果表明NX-6的基因主要聚集在新陈代谢、遗传信息处理和环境信息处理，其中新陈代谢通路主要包括碳水化合物代谢（199 个基因）、氨基酸代谢（162 个基因）、核酸代谢（88 个基因）、能量代谢（69 个基因）、辅助因子与维生素代谢（61 个基因）、脂质代谢（43 个基因）、糖的生物合成与代谢（36 个基因）、次级代谢产物合成（31 个基因）等（图2B）。COG数据库注释结果同样表明，代谢相关的基因功能主要集中于氨基酸、碳水化合物、核酸、脂质的转运与代谢（图2C）。此外，VFDB数据库分析结果表明，动物双歧杆菌NX-6基因组中无毒力基因，证明其生物安全性。特别的是，动物双歧杆菌具有丰富的脂质代谢通路以及色氨酸代谢通路基因簇。
表1 动物双歧杆菌NX-6基因组信息
图2 动物双歧杆菌NX-6的全基因组测序与生物信息学分析
2.3 动物双歧杆菌NX-6对斑马鱼体内TG和TC含量的影响
如图3A、B所示，当NX-6浓度为1×104、1×105、1×106 CFU/mL时，斑马鱼油红O染色变浅，且测得斑马鱼体内相对脂肪水平分别为（132.31±14.76）%、（119.87±8.19）%、（101.14±5.27）%，随着NX-6浓度的增加，斑马鱼体内相对脂肪水平降低，与模型组（（184.38±7.06）%）相比高度显著降低（P＜0.001），说明动物双岐杆菌NX-6在实验浓度下能降低斑马鱼体内脂肪含量。由图3C、D所示，当NX-6浓度为1×104、1×105、1×106 CFU/mL时，斑马鱼体内TC含量分别为（0.091±0.001）、（0.099±0.002）、（0.093±0.003）μmol/mg，高度显著低于模型组（（0.120±0.002）μmol/mg）（P＜0.001），TG含量分别为（0.090±0.001）、（0.031±0.000）、（0.100±0.001）μmol/mg，高度显著低于模型组（（0.131±0.002）μmol/mg）（P＜0.001）。
图3 动物双歧杆菌NX-6对斑马鱼体内脂肪含量的影响
2.4 动物双歧杆菌NX-6发酵上清液的非靶向代谢组学分析
为了确定NX-6中起降脂功效的关键代谢物，对其发酵上清液进行非靶向代谢组学测定。主成分分析（principal component analysis，PCA）结果表明，NX组与BS组相互独立且不同，说明NX-6的代谢活动显著改变了培养基中的物质成分（图4A、B）。对所有代谢物进行差异倍数（fold change，FC）分析，并在每种模式的火山图中突出显示FC＞1.5或FC＜0.67且P＜0.05的差异代谢物，结果如图4C、D所示。NX组和BS组之间的代谢物谱有显著差异。基于偏最小二乘判别分析（partial least squares-discriminant analysis，PLS-DA）进一步寻找差异代谢物，结果表明PLS-DA模型稳定可靠，两组间差异具有统计学意义（图4E、F）。
图4 动物双歧杆菌NX-6发酵上清液的非靶向代谢组学分析
采用t检验选取变量投影重要性（variable importance in projection，VIP）＞1且P＜0.05的代谢物作为鉴别代谢物，在阴离子模式下检出42 个差异上调代谢物、55 个差异下调代谢物；在阳离子模式下检出57 个差异上调代谢物、72 个差异下调代谢物。相比于BS组，2-吲哚酮和吲哚-3-甲酸含量分别上调5.57 倍和4.61 倍，是富集程度最高的色氨酸代谢产物及其衍生物（表2）。
表2 动物双歧杆菌NX-6发酵上清液中FC排名前10的差异代谢物
2.5 动物双歧杆菌NX-6对斑马鱼中2-吲哚酮、吲哚-3-甲酸含量的影响
为了验证动物双歧杆菌NX-6色氨酸代谢衍生物2-吲哚酮和吲哚-3-甲酸在斑马鱼体内是否富集。靶向测定动物双歧杆菌NX-6处理后高脂血症模型斑马鱼体内的2-吲哚酮与吲哚-3-甲酸含量，结果如图5所示。与模型组相比，NX-6处理后斑马鱼体内的2-吲哚酮含量无明显变化，吲哚-3-甲酸含量高度显著提升1.56 倍（P＜0.001），因此推测吲哚-3-甲酸是降低斑马鱼体内脂质积累的关键代谢物。
图5 动物双歧杆菌NX-6对高脂血症模型斑马鱼体内2-吲哚酮与吲哚-3-甲酸含量的影响
2.6 吲哚-3-甲酸对斑马鱼体内TC和TG含量的影响
利用斑马鱼高脂血症模型评估吲哚-3-甲酸的降脂功效，分别使用不同浓度的吲哚-3-甲酸处理模型斑马鱼，测定斑马鱼体内的TC与TG含量。如图6所示，当吲哚-3-甲酸浓度为25、50、100 μmol/L时，斑马鱼体内TC含量分别为（0.111±0.002）、（0.108±0.001）、（0.101±0.002）μmol/mg，高度显著低于模型组（（0.148±0.001）μmol/mg）（P＜0.001），TG含量分别为（0.110±0.001）、（0.099±0.002）、（0.092±0.001）μmol/mg，高度显著低于模型组（（0.170±0.001）μmol/mg）（P＜0.001）。
图6 吲哚-3-甲酸对高脂血症斑马鱼模型TC（A）和TG（B）含量的影响
3 讨论与结论
斑马鱼作为脂质代谢研究模型已有大量文献报道，本研究采用标准化的高脂饲料喂食斑马鱼，可导致斑马鱼体内的TC和TG水平升高、脂质积累，这与He Linfeng等的研究结果基本一致。在本研究中，NX-6与商业模式菌株动物双歧杆菌BB12相比，具有更好的肠道环境耐受能力。为了更好地探究NX-6的功能，对其基因组进行分析，结果显示NX-6具有丰富的脂质代谢通路基因簇以及色氨酸代谢通路。进一步研究了动物双歧杆菌NX-6对高脂血症模型斑马鱼的降血脂作用。结果表明，NX-6降低了高脂饮食斑马鱼体内的TG和TC含量，与KEGG、COG和VFDB数据库分析预测一致，表现出了促进脂质代谢的功能。
肠道菌群中的色氨酸代谢通路在调节能量稳态中起着重要作用，作为机体内色氨酸代谢的三大途径之一，肠道微生物群将色氨酸转化为吲哚及其衍生物，主要包括吲哚丙烯酸、吲哚-3-乙酸（indole-3-acetic acid，IAA）、吲哚-3-丙酸（indole-3-propionic acid，IPA）、吲哚-3-乙醛和色胺等物质。多项研究表明，色氨酸吲哚衍生物在机体维持肠道和全身稳态、免疫平衡中发挥重要的作用，IPA的减少会导致小鼠巨噬细胞中miR-142-5p的异常过表达，进而加速动脉粥样硬化的进展；补充萝卜硫素，增加了高脂饮食喂食小鼠体内IAA的水平，丰富了肠道微生物菌群，进而降低了机体炎症强度。通过非靶向代谢组学分析NX-6发酵上清液与BS组的差异代谢物，发现NX-6发酵上清液中色氨酸衍生代谢物吲哚-3-甲酸和2-吲哚酮的含量明显上升。结合2.3节和2.4节实验结果，推测吲哚-3-甲酸和2-吲哚酮是促进高脂血症斑马鱼脂质代谢的关键代谢物。进一步分析NX-6作用后的斑马鱼匀浆液，结果显示吲哚-3-甲酸含量高度显著上升（P＜0.001）。最后利用高脂血症斑马鱼模型评价不同浓度吲哚-3-甲酸的降血脂功效，结果显示，与模型组相比，加入吲哚-3-甲酸后斑马鱼体内的TG、TC含量高度显著降低（P＜0.001），且与其浓度呈正相关，由此说明动物双歧杆菌NX-6可通过提高吲哚-3-甲酸的含量促进高脂血症斑马鱼的脂质代谢。但本研究仍存在一定不足，未能确定吲哚-3-甲酸促进TG和TC代谢的具体作用靶点和分子机制，仍需要进一步研究。
综上所述，动物双歧杆菌NX-6是一株具备耐受肠道环境胁迫能力、无毒力基因且可通过其代谢物吲哚-3-甲酸发挥降脂作用的益生菌，本研究结果可为调节糖脂代谢益生菌产品的开发奠定基础，也为益生菌降脂机制的研究提供了新思路。
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