1.2方法
1.2.1引物设计及合成
运用同源重组和质粒回补的方法构建布鲁氏菌BspE基因缺失株和回补株。在NCBI搜索牛种布鲁氏菌A19株的第一条染色体的全基因组序列(GenBank登录号:NZ_CP030751.1)，使用Snapgene软件设计BspE基因上、下游同源臂引物、缺失株鉴定引物、包含启动子区域的BspE上游引物及携带flag和去掉终止子的下游引物。引物信息见表1，引物均由擎科生物科技公司合成。
1.2.2布鲁氏菌BspE基因缺失株和回补株构建
通过同源重组方法结合电转化法构建布鲁氏菌BspE基因缺失株(图1A)，通过质粒回补方法结合电转化法构建布鲁氏菌BspE基因回补株(图1B)。
1.2.3目的基因PCR扩增
利用引物BspE-up-F/R、BspE-down-F/R，以灭活的牛种布鲁氏菌A19菌液为模板，对BspE基因上、下游同源臂进行扩增;利用引物BspE-F/R、Kana-F/R及pBB-F/R，以灭活的牛种布鲁氏菌A19菌液、pET-28a(+)和pBBR1MCS质粒为模板，分别扩增BspE、kana基因片段及pBB复制子片段。PCR反应体系25μL:牛种布鲁氏菌A19菌液3μL，上、下游引物(10μmol/L)各1μL，Primer Star Max Premix 12.5μL，ddH₂O 7.5μL。PCR反应程序:98℃预变性10min;98℃变性10s，60℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环;72℃延伸10min;4℃保存。反应完成后胶回收DNA片段，于-20℃保存备用。
1.2.4融合PCR扩增
将BspE基因上、下游同源臂片段按照1:1比例混合后作为模板，利用引物BspE-up-F、BspE-down-R，通过融合PCR技术进行扩增;将BspE和kana基因片段按照1:1比例混合后作为模板，利用引物BspE-F、Kana-R，通过融合PCR技术进行扩增。PCR反应体系和程序按1.2.3进行。反应完成后对DNA片段进行胶回收，于-20℃保存备用。
1.2.5重组质粒构建及鉴定
使用ClonExpress一步法，分别将融合的BspE基因上、下游同源臂片段与pUC19-SacB质粒、融合后的BspE和kana基因片段与pBB复制子片段进行反应，构建重组质粒pUC19-△BspE和pBB-BspE。反应体系20μL:融合DNA片段8μL，pUC19-SacB/pBB-BspE 2μL，2×ClonExpress Mix 10μL。将反应体系在50℃水浴锅中孵育45min后进行转化，筛选阳性菌落。分别以BspE-up-F、BspE-down-R和BspE-F、Kana-R为引物进行菌液PCR检测，阳性菌液送擎科生物科技公司进行测序鉴定。
1.2.6布鲁氏菌效应蛋白BspE基因缺失株和回补株的构建及筛选
将质粒pUC19-△BspE电转至牛种布鲁氏菌A19感受态细胞，经卡那抗性和蔗糖压力筛选后进行菌液PCR鉴定，筛选BspE基因缺失株A19△BspE。将提取的pBB-BspE质粒电转至A19△BspE株中，经卡那抗性筛选后进行Western blotting鉴定，筛选BspE基因回补株A19C△BspE。
1.2.7布鲁氏菌生长特性分析
将牛种布鲁氏菌A19和鉴定正确的A19△BspE和A19C△BspE进行平板划线，置于37℃恒温培养箱中培养72h，挑取单个菌落接种于15mL TSB培养液中，37℃、180r/min恒温摇床培养至对数生长期。再次分别将牛种布鲁氏菌A19、A19△BspE和A19C△BspE按照1:100比例接种于含100mL TSB培养液的锥形瓶中，37℃、180r/min恒温摇床培养，每隔8h取1mL菌液通过微生物生长曲线分析仪检测菌液D600mm值，直至72h。
1.2.8胞内增殖试验
为检测BspE基因对布鲁氏菌胞内生存的影响，按照5×10⁵/mL将RAW264.7细胞接种于24孔板中，培养12h后，将计数的牛种布鲁氏菌A19、A19△BspE与A19C△BspE按感染复数(MOI)为1:200侵染细胞，置于37℃、5%CO₂培养4h。用PBS洗3次，加入含50μg/mL庆大霉素的培养液，在37℃、5%CO₂培养箱中杀菌1h。用PBS洗3次，加入含25μg/mL庆大霉素的培养液，在37℃、5%CO₂培养箱中培养。在0、6、12、24和48h后弃培养液，用PBS洗3次，加入0.5%Triton X-100，在37℃、5%CO₂培养箱裂解细胞10min以释放细菌，通过10倍梯度稀释涂布于TSA平板上进行菌落计数。
1.2.9细菌黏附试验
细胞接种、攻菌方法同1.2.8，MOI为100。攻菌后在37℃、5%CO₂孵育1h，用无菌PBS清洗3次，加0.5%Triton X-100裂解细胞，进行10倍梯度稀释涂板计数。
1.2.10细菌入侵试验
细胞接种、攻菌、杀菌及维持培养同1.2.8。用含25μg/mL庆大霉素的培养液培养1h后，加0.5%Triton X-100裂解细胞，进行10倍梯度稀释涂板计数。
1.2.11间接免疫荧光试验
为检测效应蛋白BspE在小鼠RAW264.7细胞中的分布情况，将RAW264.7细胞按2×10⁵/mL接种于带有细胞爬片的24孔板中，攻菌、杀菌及维持培养方法同1.2.8，将未感染菌的细胞作为空白对照。感染24h后，用PBS洗3次，加4%多聚甲醛固定液，静置30min，用PBS洗3次，5min/次;加0.5%Triton X-100，室温下静置20min，使细胞穿孔，用PBS洗3次，5 min/次;加入3%BSA封闭液，37℃孵育30 min;弃掉封闭液，直接加入1:100稀释的鼠抗布鲁氏菌血清和兔抗flag抗体，4℃过夜孵育，次日在37℃复温15min，用PBS洗3次，5min/次;加入驴抗鼠和驴抗兔二抗，37℃避光孵育1h，用PBS洗3次，5min/次;加1:1000稀释的DAPI，37℃避光孵育10min，用PBS洗3次，5min/次;滴入抗荧光淬灭剂并封片，用激光共聚焦显微镜观察。
1.3数据统计分析
每组试验重复3次，试验结果以平均值±标准差表示。使用GraphPad Prism9.0软件对数据进行统计学处理，并以t检验进行差异显著性分析。P<0.05表示差异显著。