图3、PTSman在低葡萄糖浓度下对葡萄糖利用的关键作用。a.WT、ΔmanY和CΔmanY在CDM中使用六种偏好碳源的生长曲线（n=4）。b.PTS特异性活性通过测量甲苯处理悬浮液中OD340处NADH减少来检测，使用五种碳水化合物作为CDM中唯一碳源。显示的碳源为导致ΔmanY与WT相比生长缺陷显著的碳源（Glc，葡萄糖；Frc，果糖；Man，甘露糖）以及一个不导致ΔmanY生长缺陷的碳源（Suc，蔗糖）。Glc和Frc的n=6；其他n=4。c.WT在CDM中使用生理浓度CSF碳水化合物的生长曲线（n=3）。d.静脉感染5×10^6 CFU WT后，小鼠CSF中葡萄糖浓度在12 hpi、24 hpi、30 hpi和~36 hpi（濒死）时的变化（n=8）。“Blank”表示未感染的CSF。
e.WT、ΔmanY和CΔmanY在稳定期（培养12小时）在CDM中不同葡萄糖浓度（0.2 g/L、1 g/L、2 g/L和10 g/L）下的CFU（n=6）。f.接种WT、ΔmanY和CΔmanY后，CDM中残留葡萄糖的相对百分比（n=3）。残留葡萄糖相对百分比通过特定时间CDM中剩余葡萄糖浓度除以初始葡萄糖浓度（0小时）计算。g.左图：WT、ΔmanY和CΔmanY在猪CSF中体外培养的生长曲线（n=3）。右图：接种WT、ΔmanY和CΔmanY后猪CSF中残留葡萄糖的相对百分比（n=3）。h.WT和指示突变株在葡萄糖中的PTS特异性活性（n=5）。
图4、PTSman启动子赋予兽疫链球菌在低葡萄糖中的生长优势。a-c.启动子活性评估。a.来自不同链球菌的PmanX克隆到pTCV-lacZ中，并导入WT兽疫链球菌或GBSA909中以评估转录活性（n=3）。S.suis指猪链球菌，S.pneumoniae指肺炎链球菌。b.将manX上游截断区域克隆到pTCV-lacZ中以识别潜在启动子（n=3）。图示截断区域，条形图颜色与图示匹配。c.GAS和GCS的PmanX中-152至-104区域核苷酸比对显示两个核苷酸突变（n=6）。d.WT和SEZ::PmanX(A909)菌株中相对manY转录水平，通过qRT-PCR检测并归一化到recA（n=3）。e.WT、ΔmanY、CΔmanY和SEZ::P manX(A909)。
在CDM中不同葡萄糖浓度（0.2 g/L、1 g/L、2 g/L和10 g/L）下的生长曲线（n=4）。f.WT、ΔmanY、CΔmanY和SEZ::PmanX(A909)在稳定期（12小时）在CDM中不同葡萄糖浓度下的CFU（n=3，数据使用Gompertz非线性回归模型建模，后接单因素方差分析（Dunnett多重比较检验））。g.C57BL/6J小鼠静脉注射兽疫链球菌或SEZ::PmanX(A909)，濒死小鼠器官CFU计数（n=4；SEZ::PmanX(A909)感染小鼠在31至37 hpi濒死；双因素方差分析（Sidak多重比较检验）对数转换CFU数据）。h.使用数字小鼠立体定位仪将兽疫链球菌或SEZ::PmanX(A909)注射入侧脑室（5×10^6 CFU）。12 hpi时脑和CSF CFU计数（n=4；单因素方差分析（Dunnett多重比较检验）对数转换CFU数据）。n表示来自不同单细菌克隆（a-f）或小鼠（g,h）的生物学重复。
图5、PTSman依赖的严谨反应旁路促进兽疫链球菌在低葡萄糖浓度下增殖。a.WT、ΔmanY、CΔmanY和SEZ::PmanX(A909)菌株中相对relQ转录水平，通过qRT-PCR检测并归一化到recA（n=3）。b.WT、ΔmanY、CΔmanY、ΔrelQ、ΔmanYΔrelQ、ΔmanYCΔrelQ和relQ菌株在CDM中1 g/L葡萄糖下0小时、4小时和12小时的CFU（n=3）。relQ指含有relQ过表达质粒（pSET2-relQ）的兽疫链球菌。c,d.核苷酸提取后通过TLC检测细胞内(p)ppGpp水平。细菌在CDM中1 g/L葡萄糖（c）或1 g/L（低）与10 g/L（高）葡萄糖（d）下生长。e.WT、ΔmanY、CΔmanY和SEZ::PmanX(A909)菌株在CDM中1 g/L或10 g/L葡萄糖下生长的HPr磷酸化和Crp表达的Western blot分析。GroEL作为加载对照。
SDS-PAGE（十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳）用于分离Crp和GroEL。Native PAGE用于以天然构象分离HPr和P-HPr。f.EMSA评估relQ启动子与Crp或Crp:cAMP复合物的结合。g.WT、Δcrp、ΔmanY和ΔmanYΔcrp菌株中relQ相对转录水平，通过qRT-PCR检测（n=3）。数据归一化到recA。h.兽疫链球菌WT、Δcrp、ΔmanY和ΔmanYΔcrp菌株细胞内(p)ppGpp水平，通过核苷酸提取后TLC检测。细菌在CDM中1 g/L葡萄糖下生长。i.示意图模型说明PTS系统与严谨反应之间的通路。在低葡萄糖条件下，兽疫链球菌通过PTSman运输葡萄糖，导致HPr磷酸化。高P-HPr比率与Crp表达降低相关，从而抑制cAMP::Crp复合物激活relQ，防止(p)ppGpp积累和严谨反应启动。
总结
新兴人畜共患病原体马链球菌兽疫亚种（Streptococcus equisubsp.zooepidemicus）在脑膜中的增殖与猪死亡率和人类发病率相关。高毒力兽疫链球菌在脑脊液（CSF）中显著增殖能力的机制尚不明确。本文通过使用基因条形码标记的兽疫链球菌，发现在小鼠系统性感染后，仅有约1-10个兽疫链球菌克隆侵入脑膜，随后在此复制约10^7倍。后续的转座子插入测序实验及细菌甘露糖磷酸转移酶系统（PTSman）缺陷株的验证工作，鉴定出PTSman（负责葡萄糖摄取）对兽疫链球菌在CSF中增殖至关重要。兽疫链球菌PTSman启动子赋予该物种特异性的PTSman组成型转录，使其能够在低葡萄糖浓度下获取葡萄糖，并限制严谨反应的激活，从而导致病原体在CSF中的复制。
本研究首次揭示了兽疫链球菌通过优化葡萄糖摄取系统适应脑脊液环境的独特策略。其PTSman启动子的高活性是该菌在脑膜炎中表现出超强增殖能力的重要进化适应。这一发现不仅深化了对细菌中枢神经系统感染机制的理解，还为开发新型治疗策略提供了方向。针对PTSman的抑制剂可能成为抗生素的辅助疗法，通过限制病原体葡萄糖摄取减轻脑损伤，提高治疗效果。BIOSCREEN全自动生长曲线分析仪作为核心表型分析工具，评估了野生型（WT）、manY基因缺失突变株（ΔmanY）及其回补株（CΔmanY）在不同碳源中的生长情况。通过定量生长动力学将遗传突变与代谢表型关联，最终帮助揭示了兽疫链球菌通过PTSman规避严谨反应、在脑脊液中爆发性增殖的独特机制。该研究通过整合遗传条形码技术、转录组学和生化分析，系统阐明了兽疫链球菌在苛刻环境中维持代谢优势的分子基础，为控制该类人畜共患病提供了重要理论依据。
相关新闻推荐
2、最佳培养条件下沙福芽胞杆菌生长曲线与CA活性曲线测定及研究（一）