3.6.圆二色性
我们在pH 7.4的10 mM磷酸钠缓冲液和膜模拟溶剂中检查了6、8和10个残基的线性和环肽的二级结构。
线性肽在两种介质中均显示无序结构。在磷酸盐缓冲液中，所有环肽都表现出类似的无序CD光谱。相比之下，在40-50%TFE中，环肽变得结构化，如在205和220 nm附近观察到的两个局部最小值以及在195 nm附近的正带所示。这些肽的光谱与短杆菌肽S相关环肽观察到的光谱相似，表明形成了β-折叠结构。
在100%TFE下获得最高的摩尔椭圆度值。L-非对映异构体BPC10L和BPC8L在TFE中的[θ]208值相似，范围从-17,866到-18,395。环六肽BPC6L显示出较低的[θ]208值。D-非对映异构体显示的[θ]208值低于相应的L-对应物，其中环六肽BPC6D是排序度最低的肽。在BPC8L中用Leu替换Phe显著破坏了二级结构。
图3-BPC8L和BPC8D在pH 7.4的10 mM磷酸钠缓冲液中不同TFE浓度下的CD光谱。BPC8L在0%TFE中(---)；BPC8L在50%TFE中(----)；BPC8L在100%TFE中(-)；BPC8D在100%TFE中(---)。
4.讨论
在这项研究中，我们研究了4-10个残基的小头尾环肽对具有重要经济价值的植物病原细菌解淀粉欧文氏菌、丁香假单胞菌和辣椒斑点病菌的抗菌活性。环肽通过交替亲水性和疏水性残基设计。环化、环大小和用D-Phe替换L-Phe影响疏水性、两亲性，并导致抗菌和溶血活性、选择性以及对蛋白酶消化稳定性的差异。
环化显著增加了肽序列的抗菌活性。具有偶数个残基的肽表现出更高的抗菌活性，其中环十肽BPC10L是最活跃的。此外，观察到对本次研究中测试的细菌菌株的选择性。它们对解淀粉欧文氏菌无活性，但对丁香假单胞菌和辣椒斑点病菌显示出显著的活性。与之前的结果一致，辣椒斑点病菌是最易感的病原体。细菌对氨基酸序列不同的肽的这种不同易感性水平归因于目标微生物血浆膜成分的变化，例如电荷和脂质组成，这将影响阳离子肽在膜中的结合速率。正如之前用其他线性阳离子十一肽所描述的，BPC10L、BPC10D、BPC6L和BPC6D在MIC附近的浓度下对辣椒斑点病菌和丁香假单胞菌显示出杀菌作用。
阳离子肽对革兰氏阴性菌的作用是由肽残基与目标膜之间的静电和疏水相互作用驱动的。为了最大化这两种相互作用，可能需要形成两亲性结构。tR的测定已成功应用于表征两亲性螺旋和β结构肽，tR的增加与增强的两亲性相关。环肽显示出比其线性对应物更高的tR值，意味着与疏水表面的相互作用增加。因此，我们的结果指出，环化施加的构象限制促使肽采用具有明显疏水和极性结构域的两亲性结构，这解释了改进的抗菌活性。这些结果与在膜模拟溶剂中通过CD光谱观察到的二级结构形成非常一致。这些肽的光谱不是传统β-折叠光谱的特征，并且类似于α-螺旋的代表性光谱。短杆菌肽S和短杆菌肽S相关环肽也观察到类似的结果。事实上，短杆菌肽S样CD光谱被认为是β-折叠结构形成的良好指标。
已观察到二级结构形成的程度影响抗菌和溶血活性。BPC8L和BPC10L对细菌和红细胞表现出高活性，这可能归因于它们的高二级结构含量。在BPC8L中用Leu替换Phe导致肽BPC8S1具有降低的二级结构和生物活性。类似地，当在我们的环状序列中引入D-Phe时，也观察到抗菌和溶血活性降低。这种减少可以通过它们的低二级结构含量和低tR来解释，这意味着低两亲性特征。环肽之间观察到的生物活性差异表明，非极性面的疏水性调节微生物和溶血活性。D-氨基酸掺入对破坏β-折叠结构和疏水性的影响已在与短杆菌肽S相关的环肽类似物中描述。
对细菌和人类细胞的选择性被发现取决于环的大小。与抗菌活性不同，溶血作用确实与环大小相关。环四肽观察到最低的溶血活性，而环十肽对细菌最活跃，但溶血性最强。因此，环大小的增加与对细菌和人类细胞选择性的丧失有关。这种选择性的基础归因于膜脂组成的差异。酸性磷脂的缺乏和甾醇的存在降低了真核细胞对裂解肽的敏感性。当疏水性超过某个值时，肽的选择性就会丧失，因为肽变得既有溶血性又有抗菌性。正如具有偶数个残基的环肽在RP-HPLC中的保留行为所表明的那样，疏水性随着环大小的增加而增加，为环十肽提供了最低的MIC值和最高的溶血活性。
蛋白酶消化稳定性是抗菌肽所需的特性，以确保分子在植物环境中具有合理的半衰期。来自附生微生物或植物内部组织固有的蛋白酶可能会降解抗菌肽。D-氨基酸取代和肽环化是常用于提高肽稳定性的方法。当比较BPC10L、BPC10D和相应线性肽对蛋白酶降解的敏感性时，已经观察到这种趋势。因此，D-非对映异构体BPC10D及其线性类似物的消化比其L-对应物进行得慢得多。类似地，环肽BPC10L的降解明显慢于其线性衍生物。
总之，我们从头设计了由交替的亲水性和疏水性氨基酸组成的4-10个残基的头尾两亲性阳离子环肽，它们在体外对具有重要经济价值的植物病原细菌丁香假单胞菌和辣椒斑点病菌有效。我们已经证明，对于这些肽：环化施加的构象限制是生物活性的要求，这也增加了肽的稳定性；观察到含有偶数个残基的环肽具有更高的活性；引入D-氨基酸导致较低的抗菌、溶血活性和较高的蛋白酶降解稳定性；结构化程度影响两亲性，意味着非对映异构体之间的活性差异；疏水性的改变影响抗菌效力和细胞毒性之间的平衡。肽BPC10L、BPC8L和BPC4L表现出最高的抗菌活性，MIC值范围为6.25至25μM。尽管这些肽在活性方面无法与链霉素等抗生素相媲美，但它们的小尺寸和简单结构使其成为开发用于植物保护的有效抗菌剂的潜在候选者。
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