1 材料与方法
1.1 试验材料
1.1.1 细胞、毒株及试剂
亲本病毒株(FHV-1 H07)由浙江迪福润丝生物科技有限公司提供; 猫肾细胞(F81)购自中国科学院细胞库; Stbl3大肠杆菌感受态细胞购自北京金沙生物科技有限公司; 琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒、无内毒素质粒小提试剂盒购自天根生化科技(北京)有限公司; 2×Rapid Taq Master Mix购自南京诺唯赞生物科技股份有限公司; Body fluid Viral RNA购自爱思进生物技术(杭州)有限公司; Lip2000购自赛默飞世尔科技(中国)有限公司; DEME、胎牛血清购自南京生航生物技术有限公司; 4%多聚甲醛固定液购自Phygene Scientific(美国); 草酸铵结晶紫染色液购自上海麦克林生化科技有限公司; T4连接酶购自NEB(美国)。
1.1.2 主要仪器
CO2恒温培养箱(311)、高速离心机(LEGEND MICRO 17)购于Thermo Scientific公司; 洁净工作台(SW-CG-2FD)购于苏净集团苏州安泰空气技术有限公司; 基因扩增仪(TC-E-480)购于杭州博日科技股份有限公司; 荧光显微镜(CKX3-SLP)购于杭州全谱实验室设备有限公司; 蓝光切胶仪(T-48)购于浙江迪福润丝生物科技有限公司; 核酸电泳仪(DYY-6C)购于北京六一生物科技有限公司。
1.2 试验方法
1.2.1 FHV-1
gIgE基因左右同源臂序列的获取 提取亲本病毒FHV-1 H07基因组DNA作为模板,根据GenBank(登录号 FJ478159.2)C-27株的序列设计扩增包含gIgE左同源臂、gIgE基因以及gIgE右同源臂整个片段的引物,引物序列为gIgE-F/R:aaaacccgatagatacgaagag/cgaataaatgaagaatctaccg,产物大小3 789 bp,将产物进行测序,从而获取gIgE基因左右同源臂的序列。
1.2.2 转移载体的合成
将gIgE基因左右同源臂、红色荧光蛋白RFP基因序列送至金唯智生物科技有限公司,合成针对gIgE基因的转移载体,命名为pUC-gIgE-L-RFP-R。
1.2.3 sgRNA质粒的构建
设计3条针对gIgE基因的sgRNA,引物序列如表1所示。使用T4聚合酶将sgRNA-oligo退火成双链,通过PCR合成sgRNA1、sgRNA2、sgRNA3片段。将质粒pX458-Neo R进行酶切,酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳并回收,使用T4连接酶与3个sgRNA片段进行室温过夜连接后转化至Stbl3大肠杆菌感受态细胞中,将测序正确的菌液进行质粒提取。
表1 sgRNA引物信息
1.2.4 重组病毒的构建
使用Lip2000将2 μg转移载体pUC-gIgE-L-RFP-R和3条sgRNA(各0.5 μg)转染至生长状态良好的单层F81细胞6孔板中,并将亲本病毒FHV-1 H07按MOI=0.1的接毒量感染细胞。6孔板置于CO2恒温培养箱培养48 h后,在荧光显微镜下观察有无红色荧光蛋白(RFP)表达,将细胞培养混合液冻融1次后吸取上清液,按10-1～10-6稀释度分别接种F81细胞6孔板,接种6 h后于每孔加入30 ℃、1.5 mL 10 g·L-1低熔点琼脂糖(20 g·L-1低熔点琼脂糖与20 g·L-1FBS DMEM培养基按体积比为1:1的比例混合)。待琼脂糖冷却凝固后置于CO2培养箱中培养72 h,在荧光显微镜下挑取表达RFP的噬斑,洗脱到500 μL 20 g·L-1 FBS DMEM培养基中。将噬斑洗脱液冻融1次后再分别按10-1～10-6稀释度接种F81细胞,培养并挑取噬斑。反复此操作直到显微镜中视野下表达RFP的细胞病变占总细胞病变的80%～90%时,将噬斑洗脱液进行有限稀释,按10-6～10-8稀释度分别接种F81细胞。每个稀释度接种96孔板,每孔100 μL病毒液,置于CO2培养箱培养。72 h后在显微镜下筛选细胞病变处有RFP表达的单个孔,96和120 h再次观察筛选出来的单个孔是否有野毒生长。最终将筛选出来的单个孔中的培养物冻融1次,12 000 r·min-1离心2 min,吸取上清液并保存。
1.2.5 重组病毒的鉴定
将筛选出的重组病毒进行测序。设计分别用于验证RFP和gIgE的引物对,引物序列如表2所示。提取重组病毒的基因组作为模板进行PCR,以亲本病毒H07的结果作为对照,将进行琼脂糖凝胶电泳后有目的条带的PCR原液测序。
表2 鉴定重组病毒的引物
1.2.6 重组病毒与亲本病毒组织半数感染量(TCID50)的测定
将重组病毒与亲本病毒原液从10-1稀释到10-10,接种到含生长状态良好的F81细胞的96孔板中,每孔100 μL病毒液,每个稀释度3个重复,置于CO2培养箱中培养72 h后在荧光显微镜下记录每个稀释度有荧光或有细胞病变的孔数,用Reed-Muench方法计算重组病毒与亲本病毒的TCID50。
1.2.7 重组病毒的稳定性分析
将重组病毒在铺满F81细胞的48孔板中进行传代观察。48 h后待所有细胞都完全病变时,将培养液冻融1次并继续传下一代。从F1传至F10,每一代均需在荧光显微镜下观察重组病毒RFP的表达情况。
1.2.8 重组病毒的体外生长特性分析
在铺有F81细胞48孔板中每孔以250 TCID50接毒量接种重组病毒以及H07病毒液,分别在24、48、72和96 h收获。每种病毒液在每个时间点设3个重复孔,用Reed-Muench方法计算收获的所有病毒液的TCID50,最后用GraphPad Prism软件绘制病毒生长曲线。
1.2.9 噬斑观察及染色
在铺有F81细胞6孔板中接种重组病毒以及H07病毒液,接种6 h后于每孔加入30 ℃、1.5 mL 10 g·L-1低熔点琼脂糖。待琼脂糖冷却凝固后置于CO2培养箱中培养48 h后在荧光显微镜下观察噬斑形态; 培养72 h后向每孔加入1 mL多聚甲醛固定液,静置30 min后吸出,再加入1 mL草酸铵结晶紫染色液静置20 min。用镊子小心将孔中的琼脂糖胶块去除,清水多次小心清洗,待孔中每个噬斑清晰可见时拍照并计数。
1.3 数据的统计与分析
采用GraphPad Prism 8.0软件绘图,应用SPSS 25.0软件对试验数据进行方差分析和t测验。
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