3讨论
同为酵母,不同来源、不同遗传背景菌株的基本特性彼此差异巨大,决定异源蛋白分泌途径表达效率的,除异源蛋白自身特性和表达载体系统外,酵母自身基于蛋白质质量控制系统调控的分泌能力是至关重要的。整体上酵母抗逆性强、生长快易培养、有翻译后修饰,能分泌到胞外,但其天然地只分泌少数几种酶,从而进化出相对低的分泌容量。而在利用木质纤维素发酵产醇的体系里,同时具有高分泌能力、高发酵能力和对各种抑制物的良好耐受性的微生物菌种无疑是最理想的。
本研究中,An-a源自工业菌株,具有较实验室菌株W303-1A更强的产醇性能;但前期研究发现其分泌表达的纤维素酶酶活性远远低于菌株W303-1A。本研究以26bp UPRE和CYC1基因起始密码子上游250bp序列组合而成的杂合启动子控制下的lacZ为报告基因来构建UPR响应指示菌株,考察将菌株对各种可能刺激源的UPR响应量化并进而比较的可行性。而研究结果证明了两个菌株对乙酸、乙醇、衣霉素和β-葡萄糖苷酶表达的UPR响应差异极为显著(图5、图6):菌株An-a对乙醇刺激的响应最强,次之衣霉素和乙醇与乙酸的混合物;菌株W303-1A则对衣霉素和基因表达的响应最强,LacZ酶活绝对值也远远高于菌株An-a相应值。这与我们前期的观察结果一致,即两个菌株相比较而言,菌株An-a产醇耐醇性能突出,而菌株W303-1A处理未折叠/错误折叠蛋白的能力强、有更高的蛋白质生产和分泌容量。
这里,衣霉素处理和β-葡萄糖苷酶表达都通过在ER中积累未折叠/错误折叠蛋白信号而激活UPR;根据西班牙Elisabet NT等人的研究,乙醇则通过改变细胞膜流动性激活UPR途径。0.3%(v/v)乙酸处理没有检测到明显的信号,与文献报道不同;分析可能的原因,一是菌株差异,二是培养和分析条件不一致,乙酸浓度不合适,有待调整。
需要说明的是,当前一般选择以RNA为基础的Northern方法或RT-PCR方法,通过检测HAC1 mRNA来检查UPR激活与否,HAC1 mRNA的剪切被认为是内质网压力的典型标志。基于下面的原因,本研究尝试先建立方便、快速的UPR响应平板定性筛检和液体培养定量检测的方法,报告基因包括lac Z、gfp、mCherry等。以lac Z为报告基因的优势在于:能方便地进行平板显色检测;酶活测定方法背景低、适用范围广、无需特殊设备,且细胞样品能冻存、时效性要求相对低。另外,酿酒酵母细胞除了依赖于Ire1和Hac1诱导的UPR应答,还包括不依赖于Ire1和Hac1诱导的UPR应答;UPRE启动子控制下的报告基因方法能实现更宽范围的筛检。
为了更准确地判断UPR激活情况,更重要的,是进一步深入分析UPR激活的具体途径和调控规律,在前面筛检基础上进行RNA为基础的分析,是必不可少的工作,目前相关的分析也正在进行中,后续会有进一步的报道。另一方面,鉴于衣霉素是最常用的UPR激活强效应剂,本研究设置的衣霉素处理对照的响应相对值,也提供了其它处理下UPR激活与否及响应值可靠性的有效参照。
综上,本研究建立的LacZ酶活指示方法能满足初步定性与定量检测UPR响应的实验需求,有望用于不同菌株、不同抑制性理化因子和不同异源基因表达的UPR响应的量化考察和对比评价,为寻找蛋白表达关键制约因素、优化酵母ER和UPR信号通路的调控奠定基础。
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