摘要
线粒体在多种疾病以及规范性衰老中起着重要作用。线粒体功能的严重减少会导致儿童疾病，如Leigh综合征，而轻微的破坏可以延长模式生物的寿命。秀丽隐杆线虫的isp-1基因编码细胞色素c氧化还原酶（电子传递链复合物III）的Rieske铁硫蛋白亚基。部分功能丧失等位基因isp-1(qm150)会导致几种多效性表型。为了更好地理解ISP-1功能的分子机制，我们试图鉴定isp-1(qm150)动物发育迟缓的遗传抑制子。在此，我们报告了一系列基因内抑制子，它们都位于ISP-1的一个高度保守的六个氨基酸系链区域内。
这些基因内突变抑制了所有评估的isp-1(qm150)表型，包括发育速率、咽部泵送速率、繁殖力、身体运动、线粒体未折叠蛋白反应报告基因的激活、CO2产生、线粒体氧化磷酸化和寿命延长。此外，当将类似的突变工程化到芽殖酵母Rieske铁硫蛋白Rip1中时，显示出相似的效果，揭示了这些残基在高度分化的物种间结构-功能关系的显著保守性。将单一亚基作为产生和抑制多种多效性表型的因果焦点，指向了一个共同的潜在分子机制，我们为此提出了一个“弹簧加载”模型。这些观察结果提供了关于门控和控制过程如何影响ISP-1在介导多效性表型（包括发育速率、运动、应激敏感性和寿命）中的功能的见解。
线粒体是通过氧化磷酸化产生三磷酸腺苷(ATP)、细胞钙缓冲、铁硫簇生物合成、活性氧(ROS)形成和细胞凋亡调节的场所。尽管线粒体功能的遗传缺陷通常与严重的儿童疾病相关，但许多与年龄相关的疾病，如心脏病、癌症、糖尿病、肥胖和神经退行性疾病，也与线粒体功能障碍有关(1,2)。
在秀丽隐杆线虫中，多项研究表明，电子传递链(ETC)活性的降低可以导致寿命延长。这些包括辅酶Q生物合成基因clk-1、焦磷酸激酶基因tpk-1和Rieske铁硫蛋白isp-1的突变。在RNAi敲低ETC组分后，其他几种蛋白质也被认为与寿命延长有关，包括HIF-1、GCN-2、CEP-1、CEH-23、TAF-4、AHA-1、CEH-18、JUN-1、NHR-27和NHR-49。此外，有人提出线粒体未折叠蛋白反应(mtUPR)直接介导了ETC抑制引起的寿命延长；然而，最近的研究表明，mtUPR的诱导对于线虫的寿命延长既不是必要的，也不是充分的。一个自洽的模型正在出现，表明isp-1(qm150)动物具有增加的ROS水平，从而诱导内源性凋亡途径的激活以延长寿命(15)。
ISP-1是一种进化上保守的、核编码的铁硫(2Fe-2S)蛋白，在电子传递链复合物III内发挥作用(16)。isp-1(qm150)等位基因导致脯氨酸到丝氨酸的替换，由于其强大的延长寿命的积极效应，已被特别深入地研究(6)。在此背景下，我们着手进一步探索isp-1(qm150)突变导致多效性表型（包括发育迟缓和寿命延长）的生化和分子机制。在此，我们报告了isp-1(qm150)基因内抑制子的鉴定，它们都位于ISP-1高度保守的六个氨基酸系链（有时也称为“铰链”）区域。这些突变抑制了与isp-1(qm150)相关的所有检查过的表型，包括先前未报道的对高氧的敏感性。此外，我们在芽殖酵母Rieske铁硫蛋白Rip1中显示了isp-1(qm150)突变与两个分离的抑制子之间的相似关系，证明了这种结构-功能关系在广泛分化的门类中具有惊人的保守性。对涉及ISP作用的物理化学参数的大量文献分析揭示了一种“弹簧加载”作用机制，在讨论中进行了总结，并在SI附录中得到了进一步支持。
实验程序
品系和生长条件。 使用标准秀丽隐杆线虫程序，如所述 (46-48)。除非另有说明，线虫在固体线虫生长培养基 (NGM) 上维持并在 20°C 下生长。为了获得同步化的 L1 群体，将卵在室温（约 20-22°C）下在 M9 中过夜孵化。胚胎后发育测定筛选在 25°C 下在固体 NGM 上进行，铺有经紫外线灭活的 OP50 (49)。品系描述见 SI 附录。
EMS/ENU 诱变筛选。 将 10,000 只 P0 isp-1(qm150) L4 用 50 mM EMS (Sigma M0880-5G) + 1 mM ENU (Sigma N3385-1G) 诱变 6 小时。然后将 P0 动物分配到 10 个独立的 15 厘米平板上。F1 动物生长至成年，通过漂白法获得它们的卵 (F2)。对于每个平板，将 3,000 个 F2 卵铺在新的 NGM 平板上。在 25°C 下 72 小时后，筛选平板上的任何快速生长动物。从每个 P0 群体中，只选择一只快速生长的线虫。
寿命分析。 寿命分析按所述进行 (49)。
显微镜检查。 在载玻片制备后立即使用尼康 Eclipse E600 显微镜和 QImaging Retigia EX CCD 相机拍摄照片，并使用 ImageJ (50) 分析荧光强度。
低氧 (0.5% O2) 和高氧 (100% O2)。 通过卵漂白制备 (51) 同步化线虫，并将其置于 NGM 上，放入 25°C 培养箱中的常压室中培养。大气被加湿，气体以每分钟一个腔室体积的速率持续流动。使用压缩空气、100% 氧气和 100% 氮气的组合，通过质量流量控制器产生低氧和高氧大气，并使用顺磁氧分析仪进行分析，该分析仪使用氧气标准品进行跨度校准。如果动物在诱发触摸后无法移动，则记为死亡（SI 附录）。
CO2 产生测定。 通过 COPAS Biosort (Union Biometrica) 分选 1,000 只同步化的年轻成虫，进行三次技术重复（总共 3,000 只线虫），并将其置于无食物的琼脂垫上，放入大气室中。大气室用无 CO2 空气冲洗 15 分钟，然后密封 15 分钟。使用 LI-COR 6262 CO2 分析仪测量呼出的 CO2（SI 附录）。
繁殖力大小测定。 在 20°C 下进行繁殖力大小测定，将 25 只 L4 挑到新鲜的 NGM 平板上（每板 5 只 L4），并在 4-7 天内每 24 小时将它们转移到新平板上。子代平板在 20°C 下培养约 2 天，然后计数。
摆动测定。 对于每个品系，将 10 只 L4 置于铺有 OP50 的 NGM 平板上。通过将 1 只 L4 转移到含有 1.6 mL M9 缓冲液的未铺板平板上进行摆动测定，并在 1 分钟、5 分钟、10 分钟、15 分钟和 20 分钟的间隔内，每次持续 1 分钟，对摆动进行评分。
咽部泵送测定。 L4 线虫在 NGM-OP50 上适应 20 小时。测定在约 22°C（室温）下在一天内进行。对于每个品系，在三个 10:10:10:10:10 的循环中，在有和没有慢速视频辅助的情况下，对 30 只线虫的咽部收缩进行计数，并将这些测量值外推为每分钟泵送次数。
线虫分选。 使用 COPAS BIOSORT (Union Biometrica) 根据大小区分不同的动物。飞行时间与消光被用作门控参数。根据 COPAS 应用说明 B-03，对线虫进行门控以排除卵和碎片。
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