SIR2的遗传相互作用网络包括具有肌动蛋白/微管依赖性功能、内质网-高尔基体转运和染色单体分离作用的离散必需基因
为进一步探讨被动扩散模型和因子依赖模型，我们接下来鉴定了哪些Sir2依赖性功能参与限制聚集体向子细胞的转移。因此，我们用有序的温度敏感突变体文库中包括的必需等位基因补充了先前鉴定的SIR2遗传相互作用网络。这种方法的原理基于表明未能分离蛋白损伤可导致适应性降低的数据，并且先前已表明参与蛋白损伤分配的机器可以在与sir2缺失显示合成遗传相互作用的基因中鉴定，使用合成遗传阵列分析。允许sir2缺失突变型在SGA筛选中交配和产生孢子的方案先前已有报道，包括在SIR2查询菌株中删除HMR和HML沉默交配型位点。在不同温度下测试sir2缺失与ts等位基因的杂交，因为文库中不同的ts突变体在不同的半允许条件下显示适应性缺陷。我们发现ts文库中包含的787个等位基因中有6%与SIR2显示统计学上显著的负遗传相互作用。如表S2和图3A及B所示，SIR2与参与肌动蛋白极性、肌动蛋白折叠和肌动蛋白成核的基因显示负遗传相互作用，与先前结果一致。
图3. SIR2与必需基因的遗传互作关系。A. 热图显示SIR2/ts必需等位基因双突变体在30、34和38°C下的确认生长速率变化。连接等位基因的彩色线条表明这些基因属于同一基因本体功能组：PT（蛋白质运输/转运）、 SPB /MN（纺锤体极体与微管成核）、CS（染色体分离）、PRP（蛋白酶体调节颗粒）。绿色深浅表示显著的生长速率变化（具体数值见补充表S2）；灰色表示无数据；黑色表示未观察到互作。数据以三次重复实验的平均值表示，各组比较采用双尾t检验。B. SIR2必需互作因子的网络分析图。功能组以阴影区域表示；粉红色线条代表已报道的物理互作关系，红色节点表示存在聚集体滞留缺陷的突变体。C&D. 滴落实验结果展示了SIR2-CCT1及SIR2-CMD1之间的遗传互作与上位性互作。
功能关系和已知物理相互作用的分析鉴定了SIR2相互作用网络的4个额外的先前未知功能组：1. "纺锤体极体，微管成核"，2. "内质网-高尔基体转运/功能"，3. "染色体/姐妹染色单体分离"，和4. "蛋白酶体调节颗粒"（图3A和B）。sir2缺失突变型含有比野生型细胞更高比例的未折叠/折叠肌动蛋白单体，且从sir2缺失细胞分离的伴侣蛋白CCT显示肌动蛋白折叠速率降低。一致地，cct1-2等位基因与cct6-18等位基因相似，被发现在与sir2缺失组合时导致严重的合成病态（图3C）。CCT伴侣蛋白还为微管细胞骨架系统提供折叠的微管蛋白，这可以解释为什么tub突变体在与sir2缺失组合时也显示合成病态，以及为什么"纺锤体极体，微管成核"和"染色体/姐妹染色单体分离"功能组的基因与sir2缺失负相互作用。这些组的SIR2相互作用体在功能上相关，并通过Cdc5、Mps3和Smc2之间的物理相互作用相互连接（图3B）。Mps3和Cdc5分别需要用于纺锤体极体复制和分离，且Mps3与Smc2/4凝缩蛋白复合物的Smc2物理相互作用。smc2和smc4突变体都在与sir2缺失组合时显示合成病态（表S2；图3A和B），这很有趣，因为粘连蛋白亚基Smc3在a因子处理后的sir2缺失突变型中显示乙酰化水平升高。与CCT一样，编码钙调蛋白的CMD1需要用于肌动蛋白和微管细胞骨架的正常功能。一致地，cmd1-1突变型细胞在与sir2缺失组合时生长严重受损（图3D）。
必需的SIR2遗传相互作用体还包括相对大量的参与内质网/高尔基体功能和转运的SEC基因（图3A和B）；具体而言，sec18/20/22参与内质网和高尔基体之间的逆向转运，sec7需要用于高尔基体内和从内质网到高尔基体的转运，sec53需要用于内质网腔中蛋白质的折叠和糖基化，sec11需要用于将蛋白质靶向内质网。与Sir2缓冲内质网功能缺陷一致，编码温度敏感AAA+伴侣蛋白的cdc48-3等位基因（促进从ER提取泛素化错误折叠蛋白）也与sir2缺失显示负遗传相互作用（表S2；图3A和B）。就遗传相互作用而言，"内质网-高尔基体转运/质量控制"基因组与CCT/CMD1组在功能上距离较远，表明该基因组与SIR2的遗传相互作用是由于CCT和肌动蛋白/微管功能缺陷以外的原因。
热诱导聚集体的不对称遗传需要肌动蛋白-Myo2-钙调蛋白和内质网-高尔基体转运/功能
通过使用合成遗传阵列技术将HSP104-GFP融合体杂交到必需ts突变体文库中，我们接下来测试了必需SIR2遗传相互作用网络的任何功能组是否显示热诱导Hsp104相关聚集体的异常遗传，然后测试了不对称Htt103Q遗传是否需要相同的因子。在与SIR2相互作用的所有必需等位基因中，约40%导致建立Hsp104聚集体不对称性的缺陷。受影响最严重的突变体之一是cmd1-1，编码钙调蛋白，属于参与肌动蛋白纤维组织和功能的基因组（图4A）。此外，微管蛋白（tub4-Y445D）和纺锤体极体（spc110-220）组织缺陷影响不对称性（图4A），表明核分离所需的机器也是建立聚集体不对称性所必需的。这与表明异常核分离可导致子细胞遗传蛋白包涵体（特别是JUNQ）的数据一致。除cdc48-3外，"蛋白酶体调节颗粒"和"染色体/姐妹染色单体分离"组的突变体未显示异常的聚集体不对称性，而"内质网/高尔基体转运/功能"组的所有等位基因都显示异常（图4A）。
图4. 肌动蛋白/钙调蛋白/微管蛋白、磷脂酰肌醇(4,5)-二磷酸以及内质网-高尔基体运输机制是蛋白质聚集体不对称遗传所必需的。A. SIR2必需相互作用因子的温度敏感型等位基因在胞质分裂过程中建立聚集体不对称性的能力降低；负值表示与野生型相比，不产生聚集体的子细胞比例减少。B. 在表现出聚集体不对称性建立缺陷的突变体中，聚集体遗传与清除过程发生改变：数据以突变体相对于野生型的聚集体遗传（空心柱；100%增加表示聚集体遗传值较野生型菌株增加两倍）及清除（黑色柱；100%减少表示遗传值较野生型菌株降低两倍）偏差值呈现。C&D. 显示聚集体遗传缺陷的野生型与突变体细胞群体中聚集体数量分布。E. 通过蛋白质印迹法检测显示聚集体遗传缺陷突变体中的Hsp104水平：上图展示使用抗Hsp104抗体进行的蛋白质印迹结果，下图展示使用抗pGK抗体进行的上样对照结果。F. 不同ts等位基因菌株在热激处理后聚集蛋白与总蛋白的相对比值。G. 基于ts突变体聚集体分离实验获得的代数时间函数关系分析Hsp104- GFP 聚集体遗传特征。在置信区间内记录到显著不同的遗传程度，最佳线性拟合结果表明未观察到统计学上的显著相关趋势（R² = 20.04346，P = 0.7752）。图中展示了线性回归分析中的数据点（蓝色）、拟合直线（紫色）、置信区间线（绿色）以及预测区间线（红色）。H. 在表现出异常聚集体分离的ts突变体中存在极性缺陷：四个测试的ts突变体中，cmd1-1、myo2-14和sec53-6三个均出现极性缺陷，表现为具有超过6个肌动蛋白斑块的母细胞数量增加。倍数变化基于200–300个细胞计算得出。观测差异的统计学显著性采用双尾U检验确定。I. 经极性缺陷检测的ts突变体图像：上图显示明场图像，下图通过鬼笔环肽染色显示极性表型。比例尺=5毫米。不对称性、聚集体遗传与清除情况以及每个细胞的聚集体数量数据均以三次重复样本的平均值±标准差表示；与野生型相比的统计学显著差异采用非配对双尾t检验判定。星号表示样本间存在显著差异：*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001。doi:10.1371/journal.pgen.1004539.g004
钙调蛋白调节许多过程，除肌动蛋白纤维组织外，还包括液泡遗传、内吞作用、微自噬以及纺锤体极体的组织和形成。因此，我们接下来测试这些过程/组分中是否有任何一个或全部需要用于阻止聚集体的遗传（在母细胞中滞留）、清除聚集体（在子细胞中）或两者都需要，使用ConA方案（参见图1）。CMD1突变据报道通过降低信号分子磷脂酰肌醇(4,5)-二磷酸的水平导致肌动蛋白细胞骨架缺陷。我们发现sir2缺失相互作用体mss4-102（磷脂酰肌醇(4,5)-二磷酸激酶的突变等位基因）增加了聚集体遗传并减少了子细胞中聚集体的清除（图4B）。此外，Cmd1通过与V型肌球蛋白马达蛋白Myo2的相互作用，需要用于极化生长和子细胞液泡的遗传，携带myo2-14或myo2-16等位基因的细胞，与cmd1-1细胞一样，在聚集体遗传和清除方面都显示严重缺陷（图4B）。同样，需要Cmd1以正确定位到纺锤体极体的Spc110和微管蛋白（tub4-Y445D）都需要用于聚集体的对称遗传和清除（图4B）。相反，Cmd1依赖性微自噬（由Vtc2和Vtc3介导）的缺陷不影响聚集体不对称性（图4B）。
在SIR2相互作用网络的钙调蛋白非依赖性基因中，所有参与内质网/高尔基体转运/功能和UPR/ERAD的基因在建立聚集体不对称性方面都显示缺陷（图4A），通过使用conA方案测试该组中的一些选定等位基因，包括sec53-6、sec20-1、sec22-1、sec18-1、kar2-ts和cdc48-3，我们发现所有这些基因都需要用于阻止子细胞中聚集体的遗传（图4B）。如果聚集体分配主要由于随机扩散，鉴定出的导致子细胞聚集体遗传增加的突变可能通过影响聚集体数量来做到这一点。因此，我们量化了发现需要用于不对称遗传的功能组突变体中的聚集体。该分析表明，这里鉴定的大多数需要用于聚集体不对称性的基因的缺失并未显著增加聚集体数量（图4C和D）。然而，有一些有趣的例外；Cmd1和ER伴侣蛋白Kar2活性降低导致每个细胞平均聚集体数量显著增加，表明这些蛋白是包涵体形成所必需的（图4C和D）。然而，大多数鉴定出的突变体中聚集体遗传的改变与聚集体数量的变化无关。
聚集体分配缺陷也可能是由于Hsp104水平降低所致。然而，对于这里测试的突变体，遗传缺陷并未伴随Hsp104水平降低（图4E），或通过超速离心从可溶蛋白中分离的不可溶蛋白总量升高（图4F）。为测试世代时间改变可能在多大程度上促进聚集体遗传改变，我们记录了分析的ts突变体的子细胞遗传，作为在聚集体分离分析期间获得的世代时间的函数。分析的突变体和温度产生的世代时间在野生型细胞的1.5倍差异范围内。数据经过线性回归分析以及置信区间和预测区间确定，以量化世代时间对遗传的贡献。从该分析可以得出一些重要观察结果。首先，在置信区间内（即显示世代时间差异很小的区间），记录了 vastly different degrees of inheritance（图4G），表明该组突变体中遗传的影响必须由世代时间改变以外的方式决定。其次，与被动扩散模型的预测相反，最佳线性拟合显示世代时间增加时遗传有微弱的减少趋势，但调整后的R平方值和p值分别为0.04346和0.7752，表明这一趋势在统计学上不显著。为测试sec突变体中观察到的分离缺陷是否与肌动蛋白细胞骨架组织异常有关，我们分析了肌动蛋白极性，发现sec53-5与cmd1和myo2突变体一样，显示明显异常的肌动蛋白极性（具有超过6个肌动蛋白斑点的细胞数量增加），而sec18-1突变体显示斑点数量减少（图4H和I）。因此，一些SEC和ER相关突变体可能由于极性缺陷而无法不对称地分离聚集体。
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