[摘要]目的探讨膀胱癌微环境中M2巨噬细胞通过CLDN10信号通路对膀胱癌细胞上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)的调控作用及其机制。方法收集2020年3-9月重庆大学附属肿瘤医院收治的10例膀胱癌患者的新鲜癌组织及癌旁组织标本，免疫组化观测巨噬细胞表面标志物在膀胱癌组织中的表达；对癌和癌旁组织进行转录组测序，筛选出受巨噬细胞调控的潜在基因。采用CCK-8、细胞克隆、Western blot等方法观测CLDN10对膀胱癌细胞生长和增殖的作用。结果巨噬细胞特征性分子CD68和M2型巨噬细胞CD163分子在膀胱癌组织中表达增加。对基因测序结果分析后发现CLDN10基因在膀胱癌组织中表达最显著，对膀胱癌组织免疫组化结果行免疫评分后发现CLDN10的表达与巨噬细胞在膀胱癌组织中的浸润呈正相关。Western blot检测结果表明膀胱癌组织中CLDN10蛋白的表达水平较癌旁组织高(P<0.05)。敲低CLDN10的表达后，与对照组相比，生长曲线结果表明膀胱癌细胞生长能力下降，细胞克隆形成实验结果表明膀胱癌细胞形成细胞克隆数目降低(198.0±10.3 vs 145.0±8.4，P<0.05)，Western blot检测结果表明EMT相关指标蛋白snail、twist、vimentin的表达水平降低，而E-cadherin的表达水平升高(P<0.05)。结论巨噬细胞上调膀胱癌细胞CLDN10的表达促进膀胱癌细胞EMT的发生。
肿瘤微环境(tumor micro-environment，TME)是指肿瘤细胞所在的内外环境，包括肿瘤所在组织的结构、功能和代谢，与肿瘤的发生、生长及转移密切相关。肿瘤微环境中浸润的各种免疫细胞和细胞因子构成了肿瘤的免疫微环境，主要包括巨噬细胞、CD4+T细胞、CD8+T细胞、树突状细胞、中性粒细胞、Treg细胞等。这些细胞具有促癌和抑癌的双重调节作用，而这种调节作用主要取决于免疫细胞的功能状态和类别。如何提高TME中免疫浸润细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤作用，是近年来肿瘤研究领域的前沿热点之一。例如，免疫检查点抑制剂PD-1/PD-L1单克隆抗体通过增强CD8+T细胞对肿瘤细胞的识别和杀伤作用，获得了显著的临床疗效。近年来，随着对肿瘤微环境中免疫细胞的研究越来越深入，人们意识到免疫细胞的调控功能越来越重要和复杂。
膀胱癌是中国人群泌尿系统发病率较高的恶性肿瘤之一，根据2016年CHEN等发布的2015中国癌症发病情况，膀胱癌的发生率和死亡率正逐年升高。特别是晚期膀胱癌患者，传统放、化疗治疗效果较差，而以PD-1/PD-L1单抗为代表的新型免疫治疗的问世无疑给晚期膀胱癌患者带来了新的希望。尽管如此，目前的免疫治疗方案仍面临有效率不高、疗效不确切等诸多问题。要解决这些问题，首先要深入研究膀胱癌瘤微环境中免疫细胞的种类分布及其调控肿瘤发生发展的机制。因此，本研究探讨膀胱癌微环境中免疫细胞的分布情况，发现巨噬细胞在膀胱癌组织中浸润数量明显增多；进一步采用内部测序数据筛选出受巨噬细胞调控的潜在靶基因，并用外部测序数据进行了验证，发现巨噬细胞可能通过CLDN10基因介导的信号通路对膀胱癌细胞进行调控。
1资料与方法
1.1标本来源
收集2020年3-9月重庆大学附属肿瘤医院行根治性膀胱全切的10例膀胱癌患者癌组织和癌旁组织新鲜标本，保存于福尔马林标本保存液或液氮中，分别用于免疫组化实验和Western blot实验。其中，男性8例，女性2例；年龄47~72岁，平均61.8岁。根据2010AJCC TNM分期，T1期1例，T2期8例，T3期1例；所有癌组织标本经病理诊断为尿路上皮癌。本研究经重庆大学附属肿瘤医院伦理委员会批准(2021年2月)。
1.2膀胱癌细胞系
膀胱癌T24细胞株来源于中山大学肿瘤防治中心实验研究部的基础实验室。细胞在含10%小牛血清、100 IU/mL青/链霉素的RPMI1640的培养基中培养，培养环境为：37℃、5%CO2的湿化培养箱中。
1.3免疫组化检测
将福尔马林液固定过的膀胱癌组织标本用石蜡包埋后切片，经过脱蜡、抗原修复、抗体孵育、DAB染色、封片等过程后，在显微镜下观察染色情况。对样本进行转录组测序，筛选癌组织和癌旁组织差异表达基因；依据膀胱癌组织中巨噬细胞的表达强弱进行免疫评分，分为高低浸润组，采用软件分析技术筛选出两组间的差异表达基因。
1.4 Western blot检测
将液氮中保存的膀胱癌组织标本在液氮环境下研磨后加入RIPA细胞裂解液，并离心后分离提取出蛋白上清液。然后通过配制SDS电泳凝胶、转膜、抗体孵育等步骤后，用CLDN10、Snail、Twist、E-cadherin、β-actin、GAPDH等抗体检测相应蛋白的表达。
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