1材料与方法
1.1供试昆虫与线虫
大蜡螟Galleriamellonella由甘肃农业大学植物保护学院甘肃省农作物病虫害生物防治工程实验室提供，实验用大蜡螟3龄幼虫经滞育处理，以防止吐丝、化蛹。采用对蛴螬、韭蛆及模式昆虫大蜡螟致病力及生物学特性较好的昆虫病原线虫卡森斯氏线虫0657L，均由大蜡螟老熟幼虫培养、繁殖，悬浮液贮存于4℃备用。
1.2试剂与器材
胰岛素母液(1 mL pH 2盐酸溶液加入1 mg胰岛素干粉，胰岛素干粉购于生工生物工程上海股份有限公司，纯度>95%);蒸馏水;75%酒精;林格氏液(蒸馏水1 000 mL，氯化钠8.6 g，氯化0.3 g，氯化钙0.28 g)。NBTB培养基:无菌水1 000 mL，琼脂15 g，LB琼脂预混干粉40 g，溴百里酚蓝0.01 g，摇匀，121℃，1 240 Pa灭菌20 min。LB培养基:营养肉汤8 g，琼脂15 g，酵母粉5 g，六水合氯化镁(MgCl2·6H2O)2 g，蒸馏水900 mL，摇匀，121℃，1 240 Pa灭菌20 min。玉米糖浆7 mL，玉米胚芽油4 mL，蒸馏水89 mL，混合均匀，加入无菌的培养液中。TSY液体培养基:胰蛋白胨大豆肉汤40 g/L，酵母提取物5 g/L。
体视显微镜(Stemi 305，德国Zeiss公司)，高压灭菌锅(GI54DWS，致微仪器有限公司)，超净工作台(HCB-1300V，青岛海尔生物医疗股份有限公司)，二氧化碳光照培养箱(SPX-250-GB-CO2，上海跃进器械医疗有限公司)，冰箱(BCD-656 WDPT，青岛海尔股份有限公司)，超纯水仪(GWB-2，北京普析通用仪器有限责任公司)，电子天平(ER-180，AND)，玻璃棒，酒精灯，9 cm培养皿，3.5 cm培养皿，移液枪，圆形滤纸，剪刀，接种环，封口膜，脱脂棉等。
1.3卡森斯氏线虫0657L侵染大蜡螟后共生细菌的分离、纯化和鉴定
将经过75%酒精体表消毒的大蜡螟3龄幼虫(生理活性基本一致)各5头置于垫有两层无菌滤纸的培养皿中，吸取1.5 mL 3 000头/mL的卡森斯氏线虫0657L悬浮液侵染大蜡螟，25℃培养24 h后将大蜡螟第1对胸足末端剪破，从虫体尾部向前按压至被共生细菌侵染的大蜡螟的血液从伤口处滴落在NBTB培养基上。用接菌环蘸取大蜡螟体液划Z字型后密封培养基，置于25℃培养箱中，待菌体长出，吸收培养基中溴百里酚蓝染料且菌体呈绿色的则确定为昆虫病原线虫共生细菌(杨亚贤等，2023)。将单菌落转移至新的NBTB平板培养基上，继续划线进行共生细菌的二次纯化，以此重复，直到培养纯化出均匀的单菌落。
挑取其中的初生型单菌落转移至LB平板培养基，在25℃培养箱中培养72 h后将共生细菌单菌落挑取至TSY培养基中，在28℃180 r/min摇床中培养48 h，得到共生细菌发酵液，4℃保存备用。经课题组鉴定，卡森斯氏线虫0657L的共生细菌为伯氏致病杆菌Xenorhabdusbovenii0657L(张文德等，2023)。在LB培养基上接种上述纯化的共生细菌伯氏致病杆菌0657L作为卡森斯氏线虫0657L的食物，25℃恒温培养。
1.4胰岛素对卡森斯氏线虫0657L寿命、运动能力和吞咽能力的影响的测定
在光学显微镜下将卡森斯氏线虫0657L怀卵大母虫挑至新的用划线法培养有伯氏致病杆菌0657L的LB培养基中，子代产出后将大母虫挑走，子代继续置于25℃中培养。为了抑制卡森斯氏线虫0657L产卵，子代幼虫期的第0-5天LB中含5μmol/L五氟尿嘧啶，待卡森斯氏线虫0657L生长至第6天时转至普通的LB上，此时的线虫生长至同一生长时期J3。
挑取NBTB培养基上菌落大小一致(挑取的菌量也基本一致)的伯氏致病杆菌0657L单菌落至直径3.5 cm的LB培养基上，随机分为8组，随后每个单菌落立即分别滴加10μL胰岛素母液与林格氏液体积比为1∶500和1∶5 000及林格氏液(现配现用)，另设1组不加胰岛素和林格氏液的空白对照，处理后每24 h在体视显微镜下用十字交叉法测量菌落直径1次并记录，计算1～6 d时伯氏致病杆菌0657L的生长速率，生长速率(%)=(Dt-Dt-1)/t×100(D为共生细菌单菌落直径;t为时间，单位d)。将同期化J3卡森斯氏线虫0657L转移到上述胰岛素处理48 h时的伯氏致病杆菌0657L的LB上培养，此时记为实验第0天。为保证食物充足和药物浓度，每3 d将卡森斯氏线虫0657L转移至新的接有胰岛素处理的伯氏致病杆菌0657L的LB上，每天监测卡森斯氏线虫0657L的存活情况，直至所有卡森斯氏线虫0657L死亡(卡森斯氏线虫0657L对铂丝的轻微机械触碰无反应即视为死亡)，记录存活时间，计算寿命和存活率。每组至少3个重复，每个重复30条线虫。
随机选取胰岛素处理3 d(3龄幼虫)，7 d(4龄幼虫)和11 d(成虫)时的卡森斯氏线虫0657L挑取至未培养伯氏致病杆菌0657L的空白LB培养基上，使其在自由运动过程中除掉虫身黏附的共生细菌后，记录30 s内卡森斯氏线虫0657L头部来回摆动的次数(即为衡量卡森斯氏线虫0657L运动能力的标准)，从一侧摆动到另一侧再摆回来视为1次。每组至少5条线虫，每条线虫统计至少统计3次，取其平均值作为最终结果。随机选取胰岛素处理3 d(3龄幼虫)，7 d(4龄幼虫)和11 d(成虫)时的卡森斯氏线虫0657L，直接在卡森斯氏线虫0657L生长培养基上对其30 s内吞咽次数进行统计，用铂丝轻轻触碰卡森斯氏线虫0657L，观察并记录卡森斯氏线虫0657L咽部中食道球前后抽动次数。每组至少5条卡森斯氏线虫0657L。每条卡森斯氏线虫0657L至少统计3次，取其平均值作为最终结果。
1.5数据分析
卡森斯氏线虫0657L寿命数据采用long rank test统计方法，伯氏致病杆菌0657L菌落直径和生长速率以及卡森斯氏线虫0657L运动和吞咽数据采用LSD多重比较法进行差异显著性分析，所用分析及作图软件包括Excle 2016，SPSS 19.0和Origin 2021等。